脐血间充质干细胞治疗帕金森病研究现状
间充质干细胞（mesenchymalStallcells，MSCs）作为一种成体干细胞，具有未分化细胞的特性，能高效率的自我更新，并且有着向多种成熟细胞分化的潜能。在生物医学和组织工程中具有巨大的科研价值。骨髓是第一个被报道含有MSCs的组织来源，也是如今临床应用的主要来源，但获取过程有创。易导致感染、出血、慢性疼痛，并且其增殖、分化潜能均随年龄的增长而降低。因此对于老年患者的效果得不到保证。我国现已逐步进入老龄化社会，临床上帕金森病（Parkinson’sdisease。PD）患者已达到200万人。每年新增PD患者近20万人。如不及时进行有效的治疗，患者病情呈慢性进行性加重，晚期往往全身僵硬、活动受限，其中约30％的中晚期患者生活不能自理，最后死于各种并发症闭。近年来，有研究者从人脐带血（humanumbilicalcordblood，HOCB）中分离出MSCs。并且成功将其分化为成骨、软骨、脂肪等中胚层细胞及外胚层的神经元。由于脐血取材容易，来源丰富，免疫原性较弱。能耐受更大程度上的人类白细胞抗原配型不符等诸多优势，被众多学者推荐为骨髓的替代来源。本文就脐血MSCs的分离及其效率、生物学特性、体外诱导分化情况以及移植治疗PD前景做如下综述。
一、脐血的组成成份
目前认为。脐血中不但含有丰富的造血干细胞Oaematopoieticstemcells。HSCs）。还存在多种非造血干细胞和前体细胞，如MSCs、内皮前体细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）和非限制性体干细胞（unrestrictedsonmticstemcells，USSCs）等。Ingram等根据EPCs的克隆形成和增殖潜能。在EPCs中鉴定出一种新的细胞群并命名为高增殖潜能。I-IPP、ECFCs），这些细胞能够完成超过100次群体倍增。可以形成二级和三级集落，并保持很高的端粒酶活性。同时Kogler等发现，改变分离和培养条件，可使USSCs向MCSs方向转化，且USSCs不表达透明质酸酶I（HASl），因此可将USSCs认为是MSCs的早期中胚层前体细胞。也有学者采用X、Y染色体特异的DNA探针进行荧光原位杂交发现。脐血里的MSCs来源于胎盘的胎儿面细胞。
二、脐血MSCs分离及其效率
迄今为止。足月的HUCB是否能成为分离多能MSCs的来源依然存在争论。Wexler等在MSCs条件培养基里培养出来的第二代成纤维样贴壁细胞CD45、CDl4呈阳性表达，而CD44、CD90、CD29阴性表达。由此得出结论：CB贴壁单核细胞具有的是HSCs形态学特征而非MSCs。随后，越来越多的研究小组成功从足月HUCB中分离出MSCs，但大多由于HUCB中MSCs含量低（不超过骨髓含量的1／3），培养条件要求高，个体差异性大，导致分离成功率低下。Perdikogianni等在高接种密度、高样本容量、高浓度成纤维细胞生长因子-2促分裂增殖的情况下。也只从25％HUCB样本中分离出MSCs。并且原代培养时间长达34d，随后需要55d才可继续传代。也有学者在排除孕龄和生产方式对MSCs获得率的影响后得出分离培养脐血MSCs的最优化条件：样本处理时间≤15h、样本量I〉33mL、接种数≥103、胎牛血清包被培养瓶、无凝血、无溶血，成功率从28。8％提高到63％。已有报道证明早产儿脐血分离MSCs成功率明显高于足月产，表明早产儿脐血中含有更多的MSCs，这可能与发育过程中造血部位向骨髓的迁移有关。另外，HUCB冻融易造成凝血，严重影响单核细胞的提取。几乎得不到贴壁的MSCst1。总之，影响HUCB分离效果的因素很多，包括MSCs大小、表面粗糙程度、疏水性强弱、细胞弹性强弱等。目前的分离方法和技术尚不能达到像骨髓、脂肪、脐带等来源MSCs的分离效率。因此，尽管HUCB来源丰富。但是不是以后MSCs临床治疗的有效来源依然是研究者争论的焦点问题。
三、脐血MSCs体外生物学特性
原代培养的脐血MSCs表现的是一种混杂的细胞群。包括破骨样细胞和成纤维样细胞。破骨样细胞显微镜下表现出形态多样性。增殖能力有限，随着传代会被逐渐去除。而成纤维样细胞（aPMSCs）镜下表现为均一的双极长梭形。胞体较骨髓MSCs稍小，成克隆样生长。约3~4周可达到融合状态，〉85％的细胞处于早期静止未分化状态。具有很强的增殖分化潜能。有报道称脐血MSCs体外可连续培养60代，并对前42代细胞进行染色体组型分析发现长期培养的脐血MSCs仍可保持稳定的染色体型（46-XY），意味着可以保留其原有的增殖分化及自我更新的能力。这是与骨髓MSCs相比最明显的优势之一。
目前脐血MSCs的鉴定主要是通过形态、功能以及在培养过程中出现的分化表型等分析，尚没有直接的方法能鉴定脐血MSCs。但大多研究证明脐血MSCs阳性表达典型的MSCs表面标志CD29、CD44、CD73、CD90、CDl05、CDl66以及于细胞标志CDl33。阴性表达造血f细胞标志CDlla、CDllb、CDl4、CD34、CD45tul。另外不表达MHC。Ⅱ类抗原及共刺激分子B7-1（CD80），B7-2（CD86）和CD40／CD40L。故不能识别异体基因抗原，且由于缺少免疫激活信号传导中两条共同刺激通道，从而具有免疫耐受特性。
四、脐血MSCs体外诱导分化
关于脐血MSCs体外诱导分化的具体机制尚不明确。目前认为主要与细胞外环境和细胞内基因的选择性表达有关。近年来。研究者对脐血MSCs体外定向诱导分化方法做了大量的研究。主要是通过细胞因子、生长因子、化学抗氧化剂改变细胞外局部微环境或者导入特定基因影响相关蛋白表达对分化进行调控。Kogler等从脐血中分离的CD45一细胞体外不但可以分化成成骨细胞，软骨细胞、脂肪细胞和造血细胞，用含有神经生长因子mGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、双丁酰环磷酸腺苷（曲-cAMP）、异丁基甲基黄嘌呤（mMX）和维甲酸（RA）的培养基进行诱导4周后发现，脐血MSCs也可跨胚层向神经元分化。包括星形胶质细胞和表达神经微丝蛋白（NF）、钠通道蛋白和多种神经递质的成熟神经元，并且有〉30％的细胞酪氨酸羟化酶（TH）表达阳性。也有学者采用3步诱导法：〔（1）胰岛素一铁传递蛋白一硒补充剂（ITS）、B27、bFGF、RA诱导l周；（2）ITS、B27、db。cAMP、抗坏血酸（从）诱导4d；（3）rrs、B27、forskolin、IBMX、AA诱导3d1成功诱导出成熟神经元。并且RT。PCR检测到中脑多巴胺（DA）能神经元转录相关基因、Null、Ptx3、Pax2、Wntl和mRNA的表达，这为脐血MSCs移植治疗PD提供了可能性。Greschat等旧用XXL条件培养基诱导脐血MSCs7d后神经十细胞标志DCX表达阳性率为（84。70+2。96）％。14d后早期神经元标志NF及pIII-mbulin表达阳性率分别达（63。10±2。15m和（61。10±2。52）％，21d即可检测到成熟神经元标志突触素（s”）和神经元核fNeuN）的表达，在加入诱导剂DA4h后，TH阳性率从（32。0±1。9啪上升至（78。9±1。9）％，却未见其他儿茶酚胺合成酶（DBH、PNMT）的表达，并且膜片钳及高效液相检测到大约68％的细胞可以通过L型钙通道自发分泌DA及其在神经元内的代谢产物3，4。双羟苯乙酸（DOPAC）和5。羟基吲哚乙酸（5。Hl从）。由此可见。脐血MSCs在体外不但可以分化出成熟的神经元。还可定向分化为具有功能的DA能神经元。预示着其治疗PD的可能性。但是迄今为止也没有体外完全分化成DA能神经元的报道。而且不同的诱导方案分化率也不同。因此探索其分化的具体机制及建立稳定的诱导方法是今后研究者们的主要方向。
五、脐血MSCs移植治疗PD的现状
目前，PD的治疗主要包括内科药物治疗、外科手术治疗和于细胞移植治疗。虽然药物治疗对于早期PD患者疗效确切，能够起到缓解症状的作用。但是都不能延缓本病进展。达到根治的目的，而且随着口服药物时间的延长，疾病的自然进展，单次药物的剂量需要不断加大。服用药物的间隔时间不断缩短，出现开关现象、药物耐受现象等副作用：同时。长期服用还可以加重对中脑内残余DA能神经元的损伤。PD的外科治疗对于中晚期PD患者具有较好的疗效。但是。核团毁损术由于是破坏性手术，长期疗效相对较差：脑深部电刺激（DBS）手术疗效确切，有逐渐取代核团毁损术的趋势，然而，DBS的高昂价格又限制其能够得到广泛的应用：同时，手术本身也存在着风险。而且。无论是内科治疗还是外科治疗。都只是缓解症状的手段。属于对症治疗，并不能阻止和逆转DA能神经元的变性。直到干细胞移植理论和实验研究的深入。才为PD的根本治愈提供了一种可能。脐血MSCs治疗中枢神经系统疾病不仅仅是发挥其替代作用，更重要的是可以提供神经营养促使其自我修复。而且自体同源的脐血MSCs可以排除免疫排斥的副作用。大大提高移植的成功率。脐血MSCs移植治疗创伤性脑损伤、脊髓损伤、脑缺血例及阿尔茨海默病1211已得到证实，并存在向临床转化的可能性。但是在PD的治疗上尚处于探索阶段，有学者用Hoechst33258标记的脐血MSCs植入PD模型鼠的纹状体，发现MSCs可在脑内长期存活（〉8周），并且有向病变区域迁移的趋势。同时表达神经元标志物--神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和TH，实验组DA含量明显高于对照组阎。这表明MSCs在大鼠脑内微环境的作用下可模仿神经干细胞的行为，沿着一定的路径迁移，而且有向功能神经元分化的潜能。也有学者将BrdU标记的脐血MSCs注入岳羟多巴胺PD大鼠模型的右侧纹状体。发现移植组4周后阿朴吗啡诱发的旋转行为较对照组明显减少（每30分钟大鼠旋转圈数分别为212±60、340±30）。差异有统计学意义（P〈0.05），而且无一例大鼠意外死亡。由此可见。脐血MSCs移植可有效缓解PD症状。但是治疗的具体机制目前尚未阐明。大多数学者倾向于认为脐血含有丰富的多种干细胞，在人工培养条件下或者脑内微环境诱导分化替代、修复退化的DA神经元，进而改善PD症状。另外，有研究证实脐血MSCs移植后。能促使神经元突触延伸至损伤位点。对残余的神经轴索起到保护作用，并刺激内生的神经前体细胞产生，说明其具有神经保护和促神经重建功能。
越来越多的证据证明MSCs具有低免疫原性。更重要的是它同时也有免疫调节作用阐。树突状细胞（dendriticcells，DCs）是中枢免疫系统内重要的抗原提呈细胞，脐血MSCs不但可呈浓度依赖性的抑制外周血单个核细胞的免疫反应，还可促使DCs静止在前体阶段并诱发其凋亡；同时分泌II。-6导致DCs功能缺失阁，说明脐血MSCs同样具有免疫调节作用。可作为同种异体移植有效防止免疫排斥反应而保证存活率的良好种子细胞来源。国内有学者证实中脑黑质中a-synuclein的异常过度表达可大量激活DCs而加重该区域的炎症反应。从而导致DA能神经元的凋亡册，这也是PD的重要发病机制之一。如此说来，假如脐血MSCs移植能有效发挥其免疫调节特性。则可通过抑制中脑黑质区的免疫炎性反应有效缓解DA神经元的凋亡。起到减慢PD发病进程的作用。但目前国内外尚无此类报道。这将是MSCs移植治疗PD的一个新的突破口。
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项目成果
