干货贴之「载量和上样量」
在做层析实验的时候可能时常会遇到一个问题：一次实验可以上多少样品呢？多也不是少也不是，上样多了会造成一部分样品损失或者达不到预期的分离效果，上样少了无法充分使用层析柱还要增加重复实验或者使用更大层析柱，真是件纠结的事情。我们今天要来给大家介绍的就是不同的层析柱应该如何确定上样量。
层析柱上样量由柱体积和所使用填料载量决定
● 柱体积（CV）：层析柱中装填的填料的总体积，根据层析柱的截面积及填料装填的高度计算得到。
● 载量：填料在一定条件下填料结合目的分子的能力，分为静态载量和动态载量。
静态载量（有效载量）：
在一定的条件下，可以结合在层析填料上的真实样品的数量，它是使用真实的样品和介质充分浸润饱和，然后测定结合在填料上的样品总量。pH、离子强度、添加剂以及样品等因素都会影响有效结合载量。实验条件改变，有效结合载量也会变化。
动态载量：
在一定的运行条件下，可以结合在层析柱上的样品数量。除 pH，离子强度，添加剂以及样品以外，运行流速也会影响动态结合载量。一般来说，流速越低，动态结合载量越高。如果流速接近于零，动态结合载量等于有效载量。
层析都是在一定流速下进行的，故填料的动态载量更能有效地用于上样量的确定。对于特定填料或层析柱来说，说明书都会给出对于某种特定蛋白其动态结合载量，同时给出相应的测定条件，可作为实际实验中上样量的参考。如下图给出了 HisTrap HP 的动态载量及测定条件：
● 若需要确定填料对于特定样品在特定条件下的结合载量，可通过以下方法测定实际的动态结合载量：
① 步骤一：保证时间
在ÄKTA 上连接上相应填料的 1 ml 的 HiTrap 的柱子或者小试的层析柱（如果涉及到工艺放大，小试的层析柱的高度应该与工业柱子的高度一致，保证放大前后的样品的保留时间也就是样品与填料的接触时间一致。
② 步骤二：充分平衡柱子
使用 5 个柱床体积的结合缓冲液（平衡缓冲液）充分平衡柱子。
③ 步骤三：计算动态载量
在一定的流速下（例如：线性流速 300 cm/h）连续上样（真实的样品），并且使用收集器收集穿透液，测定穿透液中的目标蛋白的含量或者活性。
上样刚开始，280nm 曲线（A280）升高，此时目标蛋白大部分结合在柱子上，所以几乎检测不到目标活性（Activity）；随着上样体积的增加，渐渐达到柱子的载量，可以在穿透曲线中检测到目标蛋白的活性。计算 QB,5%，即得到在一定流速下，一定缓冲液条件下的动态结合载量，其计算公式为：
C0 = 样品中目标蛋白的浓度（concentration of target solute in feed）。
VA = 穿透曲线中目标样品活性达到 5% C0 时上样的总体积（volume applied until the conc. Of target solute in effluent has reached 5% of C0）。
VC = 总的柱床体积（total bed volume）。
QB,5%： 一般可以根据真实的目标或者实际工艺计算 QB,5% 或者 QB,10% 作为动态结合载量。确定了使用的层析柱体积以及相应填料的载量，层析过程中上样量也就很容易确定了。
举一反三
聊完了层析柱上样量和体积与填料载量的关系之后，让我们来看一看根据层析五大原理，不同类型的层析实验应该如何保证上样量呢？
⑴ 非吸附性层析 - 凝胶过滤
组分分离：如脱盐、缓冲液置换等实验，上样体积最大可达 30% 的柱体积，通常建议为 10%-20% 柱体积。
精细分离：若使用凝胶过滤进行高分辨率的组分分离，推荐使用层析柱体积 0.5%-4% 的上样体积，不同比例取决于层析柱的类型以及样品性质。通常为了得到较好的分辨率，上样体积不超过 2% 的总柱体积。
分析分离或组分复杂的样品分离：推荐使用 0.5% 的总柱体积上样，可达到较好的分离效果。低于 0.5% 的样品体积通常不能提高分辨率。
注意：由于凝胶过滤层析上样体积受到限制，通常可对样品进行浓缩，浓度低于 70 mg/mL 通常是可以接受的，但要根据不同样品具体性质确定（考虑样品稳定性、样品黏度等）。
⑵ 吸附性层析
所使用的填料载量和柱体积共同决定。
⑶ 离子交换或疏水层析
真实上样量：对于一个给定的离子交换或疏水填料，真实上样量一般在 5~40% 的有效载量（因为带有同样性质电荷的杂质也会结合在柱子上）。
上样量：样品越复杂，上样的比例越小。若样品较简单，且目标蛋白所占比例较大，上样量可以达到 80% 的载量。
载量与上样百分比： 填料结合载量为 25 mg/ml 的 1 ml 的柱子，如果使用 80% 的载量，可上样 20 mg 的样品；若使用 40% 载量，可上样 10 mg 样品；若使用 5% 的载量，可上样 1.25 mg 的样品。
测定样品动态结合载量： 或者如果测定了真实样品的动态结合载量，直接可以使用 70% 以上的动态结合载量上样。
⑷ 亲和层析
亲和层析样品的最大上样量由填料的结合载量决定。
例如： Ni Sepharose HP 填料每毫升填料可以吸附 40 mg 的标签蛋白，如使用 5 ml HisTrap，样品最大上样量为 200 mg，若样品的浓度为 5 mg/ml，则最大的上样体积可以达到 40 ml。
但实际上样量根据样品复杂程度不同有一定差异。 另外，如果使用小柱子纯化大体积的样品，样品的准备是非常重要的，因为大量杂质可以会造成柱子堵塞，从而增加清洗成本，降低使用寿命。
