线粒体提取试剂盒说明
操作步骤：
1. 样本处理 a. 组织匀浆：称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20次； b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800g离心5~10 min收集细胞，计数。每次提取需要5×107个细胞，加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次。
2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000g 离心5 min。
3. 取上清，转移至新的离心管中，4℃，1000g再次离心5 min。
4. 取上清，转移至新的离心管中，4℃， 12,000 g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。
5. 往线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000 g 离心5 min。
6. 取上清，转移至新的离心管中，4℃， 12,000 g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。
7. 用50 -100μL Store Buffer 或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。
注意事项： 1. 为保证获得完整的线粒体，务必做到：第一，全程低温操作；第二，快速；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞，这是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解线粒体。转速与离心力换算：G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２ G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示； [rpm]２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。
