胶原蛋白载体制备及在CHO细胞培养中的应用
动物细胞培养是细胞工程中的重要组成部分,广泛用于单克隆抗体、疫苗、重组蛋白等生物药物的生产,具有广阔的发展前景和市场潜力。开发适合动物细胞培养的载体及其相应反应器,是目前动物细胞培养工程中的重要内容之一。
胶原蛋白是一种天然蛋白,具有良好的生物相容性和理化稳定性,在医药、食品等领域中有着广泛的应用。本实验以天然胶原蛋白为原料,采用铬、甲醛、戊二醛改性试剂以及铬-戊二醛、铝-植物单宁复合改性试剂对其进行化学改性处理,继之以湿热灭菌处理改善胶原蛋白理化性质,特别是胶原蛋白的收缩温度和膜通透性, 制备动物细胞培养载体。然后,在不同载体上培养 CHO 细胞,通过载体的贴壁实验、细胞葡萄糖代谢速率以及目的蛋白——促红细胞生长素(Erythropoietin, EPO)浓度对不同培养载体的生物相容性进行评价;对培养过程中细胞代谢的主要参数——葡萄糖代谢速率以及 EPO 浓度进行监测,通过这两个参数的变化对细胞的生长周期及培养周期进行预测。
总结上述实验结果,并进行分析可得出如下结论:
戊二醛改性胶原蛋白经热处理以后基本保持了原有性质,同时表面性状得到改善,更重要的是再经过湿热灭菌处理,其性状保持稳定,不发生变化,其上述性质使其可以用于动物细胞培养载体的制备。
2. 戊二醛改性胶原蛋白膜的通透性最好,对 BSA 为 2.47 mg·cm-2·h-1,对溶菌酶为 7.26 mg·cm-2·h-1,远高于天然胶原蛋白膜及其他改性剂改性膜对两种蛋白的通透性。
3. CHO 细胞在胶原蛋白载体上进行贴壁,3 小时内完成贴壁过程,之后延长贴壁培养时间对贴壁效果没有更大的影响,说明细胞在胶原蛋白载体上的贴壁比较牢固,不易从载体上脱落。
4. CHO 细胞在胶原蛋白膜载体上培养时,葡萄糖的代谢速率最高时达到 14.2mmol?ml-1?h-1,培养 10 天后 EPO 浓度达到 282 U/ml,相对于 C-DISK 培养细胞葡萄糖的消耗速率提高 16%,EPO 表达量提高近 30 %;相对于 A-DISK 葡萄糖的消耗速率提高了 13%,EPO 表达量提高近 18 %。
5. CHO 细胞培养过程中,不同的葡萄糖代谢速率,反映细胞的代谢水平和目 I的蛋白的表达强度,但这种反映并不是同步的,蛋白的代谢周期要比葡萄糖的代谢周期滞后 1-2 天,因此在细胞培养过程中,可以用葡萄糖的代谢速度对培养过程进行监控和预测, 对细胞的生长和目的蛋白的生产进行调控。
6. 胶原蛋白膜载体成本约 2.0 RMB/g, 仅为进口 A-DISK 载体价格的 5 %;自制 C-DISK 载体成本约 0.2 RMB/g,仅为进口 A-DISK 载体价格的 0.5 %。综合改性胶原蛋白膜载体在细胞生长及目的产物表达方面的优势,确定新型胶原蛋白膜载体性价比优于 C-DISK 及进口 A-DISK 载体。
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