三亲交配法将中间载体质粒导入根癌农杆菌
一、原理
用三亲交配法将中间质粒转入农杆菌的过程需要三种细菌，即含有中质粒的大肠杆菌供体菌，含有游动质粒pRK2013的大肠杆菌“协助”菌(helper)和根癌农杆菌受体菌。当这三种菌混合时，协助质粒pRK2013游动进入大肠杆菌内，提供游动(mol)和转移(tra)功能，把供体的中间质粒转移进根癌农杆菌内。该系统中中间质粒需要带有一个特定的转移起始点(ori)和活化位点(bom)，以使协助质粒的游动和转移基因对它起作用，被驱动转移。三亲结合使用的受体根癌农杆菌一般带有染色体抗性标记，如抗利福平(Rif)，供体质粒（中间质粒）常带有抗Km,
St, Tc或Ap标记，这样利用Rif+Km选择转移接合子。受体农杆菌所含的Ti质粒应是解除武装的卸甲Ti质粒。
二、目的
了解Ti质粒和根癌农杆菌的特征及植物基因转化中制备转化载体的原理，通过三亲交配法将中间质粒转入根癌农杆菌。
三、材料、试剂
1、受体菌：农杆菌LBA4404（Rifr）
2、协助菌：大肠杆菌HB101（pRK 2013）。
3、供体菌：带有中间表达载体pBI 121的大肠杆菌(Kmr)。
4、MGL固体培养。
5、LB液体、固体培养基。
6、利福平贮备液。
7、卡那霉素贮备液。
四、操作
1、接种受体农杆菌在含有100mg/ml利福平的MGL固体培养基上，28℃培养，等单菌落长出后，挑选一个单菌落接种在MGL液体培养基中，28℃振荡过夜。
2、接种协助菌在固体LB培养基上，37℃培养，等菌落长出后，挑选一个单菌落接种在LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
3、挑选带有中间载体如pB I 121的大肠杆菌（供体菌）的单菌落接种在含有50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
4、当三种菌生长到OD260为0.5左右时，等体积混匀，涂布于不含任何抗生素的MGL固体培养基上，28℃过夜培养。
5、用接种针将长出的菌落转接到含有100mg/ml利福平和50mg/ml卡那霉素的固体MGL培养基上，28℃培养3－4天，长出单菌落。
6、将长出的单菌落再次转接到含有100mg/ml利福平和50mg/ml卡那霉素的MGL固体培养基上，28℃培养3－4天，直至长出菌落。此时的受体农杆菌中带有中间质粒。通过进一步扩增，即可用于植物的转化。
