细说“三糖铁”
三糖铁试验通过测试细菌发酵糖以及产生H2S的能力，对其进行初步鉴定。细看三糖铁的配方，其中含有三种糖：乳糖、蔗糖和葡萄糖，而且葡萄糖的含量为0.1%，是乳糖、蔗糖含量的十分之一。事实上，用三糖铁琼脂进行糖发酵试验的巧妙之处，就是在于葡萄糖的含量、葡萄糖/乳糖（蔗糖）的比例，以及与18-24h培养时间的配合。
三糖铁试验中葡萄糖的发酵有两种途径，一是在培养基斜面上进行的有氧代谢。葡萄糖发酵后的中间产物丙酮酸，在有氧的条件下，通过三羧酸循环完全分解，产生CO2、水。
另一种是在三糖铁底层进行的无氧代谢。葡萄糖在厌氧的条件下，通过EMP途径分解为丙酮酸，丙酮酸再进一步分解产生各种稳定的终产物：乳酸等有机酸、醛、醇、CO2、H2。
三糖铁培养基中所用的酸碱指示剂是酚红，其在酸性条件下（pH<6）显黄色，在碱性条件下（ph>8.4）显红色。对于不发酵乳糖、蔗糖的沙门氏菌，培养开始后细菌先利用低含量的葡萄糖产生丙酮酸，斜面变为黄色。在有氧的条件下，丙酮酸继续分解为CO2和水。培养后18-24h，三糖铁斜面中低含量（0.1%）的葡萄糖已完全分解为CO2和水，细菌开始以培养基中的蛋白胨作为营养，分解蛋白胨产氨，培养基斜面中的酚红指示剂，显示为红色的碱性反应。
培养后18-24h，在三糖铁的底层，葡萄糖在厌氧的条件下分解形成有机酸，一些有机酸继续分解为CO2和H2 ，但在培养基底层中仍有部分有机酸存在，导致酚红指示剂显示为黄色的酸性反应（见图1）。
对于发酵葡萄糖和乳糖的大肠埃希氏菌、双相亚利桑那菌，以及发酵葡萄糖和蔗糖的普通变形杆菌。培养后18-24h，三糖铁斜面中较高含量的乳糖（蔗糖），还没有完全分解，中间产物丙酮酸仍然存在,此时培养基斜面中的酚红指示剂，显示为黄色的酸性反应。而在三糖铁的底层，乳糖（蔗糖）在厌氧的条件下分解形成大量有机酸，培养基底层中的酚红指示剂，也显示为黄色的酸性反应（见图2）。
对于乳糖、蔗糖和葡萄糖都不发酵的粪产碱杆菌，由于不能利用三糖铁中的糖，细菌是以培养基中的蛋白胨为营养，分解蛋白胨产氨，导致培养基斜面和底层中的酚红指示剂，均显示为红色的碱性反应（见图3）。在三糖铁琼脂上只有出现这种反应时，才可确定待测菌为非沙门氏菌。
三糖铁配方中的硫代硫酸钠和硫酸亚铁铵，是检测H2S的指示剂。一些细菌在酸性的条件，将硫代硫酸钠还原并产生H2S，H2S与硫酸亚铁铵中的铁离子形成黑色的硫化亚铁沉淀（见图4）。
操作步骤及要点
1、准备三糖铁琼脂时，斜面的长度与底层的高度最好一致。为了产生良好的厌氧环境，底层的高度应不小于3 cm.
2、待测菌宜来自沙门氏菌选择性培养基上可疑菌落，其他来源的未知菌应确保是触酶阳性的革兰氏阴性菌，另外还应进行氧化酶试验，以区分氧化酶阳性的非发酵菌。
3、从待测菌菌落的中心部位挑取菌苔，以免混入杂菌。在实际检测工作中，有时候发现在沙门氏菌选择性培养基上菌落非常典型，但其三糖铁试验的结果却难以解释。出现这种情况时，应考虑是否存在接种的菌株不纯的问题。为避免混入杂菌，也可将选择性培养基上可疑菌落进行纯培养后，再挑单个菌落进行测试。
4、用接种针进行接种，切记不要用接种环，否则会插裂琼脂破坏厌氧环境，并可能导致误判产气结果。
5、通常的接种顺序，是先在斜面划线，再于底层穿刺。笔者觉得最好先穿刺底层，再于斜面划线，这样可以防止在培养基底层漏种细菌。其实只要穿刺并确保斜面及底层都接种了细菌，斜面的划线接种已显得不是辣么铁别重要了。
6、接种完成后，不要将试管帽旋紧或试管塞塞紧，以免影响斜面氧气的供应和葡萄糖的有氧代谢。
7、将完成接种的三糖铁琼脂，置于36℃培养18-24h。
结果观察
糖发酵的结果观察
糖发酵的结果是通过培养基的颜色变化来观察。三糖铁试验的培养时间是18-24h，应在这个时间范围内观察的结果，不能提早也不要延迟。
这是因为，对于只发酵葡萄糖的细菌，如果过早观察结果（比如培养后12h或更早），此时斜面中少量的葡萄糖尚未分解完全，存在中间产物丙酮酸导致斜面呈现黄色的酸性反应，以致错误地判断该菌发酵乳糖（蔗糖）。如果延迟观察结果（比如培养后48h以上），此时底层的葡萄糖也完全分解了，细菌开始分解蛋白胨产氨，底层和斜面都出现红色的碱性反应，以致错误地判断该菌对三种糖均不发酵。
很多时候由于H2S的大量产生，三糖铁琼脂底层全部变黑，无法观察底层糖发酵的结果（见图4）。因此，有检验员在培养基底层接种时，不把接种针穿刺至试管底部，而是留出一段底层不接种细菌，以便于糖发酵结果的观察。其实出现三糖铁琼脂底层全部变黑时，可直接判断为底层产酸。因为有研究表明，在三糖铁琼脂上产H2S的细菌，同时也发酵糖产酸产气。所以各位亲，不要怕黑，还是一针到底吧。
另外小声讲一句，培养时将三糖铁琼脂的试管塞旋松，还可以减缓H2S的过量产生哈。这个小秘诀，一般人我不告诉他！嘿嘿~
需要提醒的是，当培养基的斜面和底层都出现红色碱性反应，并确定待测菌为非沙门氏菌时，应仔细检查穿刺线和斜面的划线，观察是否有细菌生长的迹象，以排除漏种细菌的情况。
对观察的结果应及时进行记录，可将培养后的三糖铁琼脂置冰箱冷藏不超过四天，但不能用冷藏后的三糖铁琼脂，再次进行结果的判读。
02
产H2S结果观察
当三糖铁琼脂出现黑色沉淀，黑色沉淀蔓延至整个底层并掩盖酸性反应，甚至斜面上也出现少量黑色沉淀；或者黑色沉淀蔓延底层并没有掩盖酸性反应；或者在底层的顶部出现一圈黑色环时，均判断为产H2S。
还要说明的是，一些在克氏双糖铁琼脂上产H2S的菌株，在三糖铁琼脂上却不产H2S，这可能是蔗糖抑制了还原硫代硫酸钠的酶。另外，也不是所有H2S阳性的沙门氏菌，在三糖铁琼脂上都产H2S。
03
产气的结果观察
首先需要指出的是，产气是指产CO2和H2，并不是指产H2S。当培养基中出现以下现象之一，可判断为产气：培养基内有单个或多个气泡；培养基开裂；培养基从试管底部全部上移，在试管底出现空腔；在试管的一侧，培养基出现缺口或凹陷（见图2）。
结果记录
三糖铁试验的结果记录，宜用规范的方式，常见的套路是先描述斜面的反应，再描述底层的反应，中间用斜杠隔开。例如，肠炎沙门氏菌三糖铁试验的典型反应为，斜面产碱，底层产酸产气，产H2S。其结果可按如下方式记录：
K/Ⓐ，H2S
注：K代表产碱，A代表产酸，○代表产气，H2S代表产硫化氢。
