脐静脉内皮细胞培养方法-2
（2）术前准备
取一根脐带（离体3个小时内，平均1小时，剪去夹伤部位）
2个50ML注射器，1个30ML注射器和1个10ML注射器
1个止血钳，2根插管，14号线2CM长，消毒巾，消毒手术刀和无菌手套
手术区域准备：一块床单和无菌手套封套
3 脐带手术操作和培养
（1）用手术刀整齐切断脐带两端
（2）静脉（口径最大的脉管）两端各导入一带有胶管的玻璃导管，用线紧绑（脐带结）
（3）用50ML的注射器吸入PBS液清洗脐带
（4）用30ML的注射器把10ML的0.2%胶原蛋白酶从静脉的一端注入，直到血管充盈为止
（5）当从另一断漏出时，用止血钳紧端口
（6）退出注射器，用止血钳夹紧胶管
（7）把脐带放在在37℃的盛有脐带缓冲液中培养15分钟
（8）其间轻轻的挤压脐带
（9）用10ML完全培养液填满一个50ML的无菌锥形离心管中
（10）用这个锥形离心管收集用40ML的PBS冲洗脐静脉出来的溶液
（11）在1000转/分下离心10分钟
（12）弃上清，再加入20ML的培养液
（13）用30ML带针头的注射器分离细胞（反复吹打推出3次）
（14）取0.1ML细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调整细胞数，以0.5-1.5×105/ML接种至24孔培养板中，每孔1ML。培养基应该放进湿度为95%，5%CO2和温度为37℃环境中。接下来的一天，通过更换培养基来把非粘附细胞移除。以后培养基每隔两天更换一次。换液时吸去原培养液的1/2--2/3，加入新鲜培养液。
三、传代培养
待细胞生长成单层后，弃培养液，PBS洗两次。0.01%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化，按1：3-1：5传代
四、血管内皮细胞鉴定
用胰蛋白酶消化的人脐静脉内皮细胞， 接种在24孔塑料培养板各孔内4h 后， 大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角、球形、呈团状， 少数细胞伸展，
48～ 72h 生长最快， 逐渐生长成梭形， 有些细胞排列呈鱼贯状相连， 间有旋祸状排列。核清晰， 呈圆形或椭圆形， 核分裂相多见， 1～ 2
核仁， 胞浆丰富， 内含小颗粒。于3～ 4 d 后融合， 7～ 10 d 胞体呈多角形，相互嵌合， 为单层呈铺路石状排列。
五、注意事项
培养内皮细胞培养基中有两样东西很重要，而且不能省：1.用好的胎牛血清 2.生长因子；此外内皮细胞很容易脱落。例如用M199干粉，加入20％小牛血清或10％胎牛血清，2ug/ml生长因子，10－20代用于实验。
六、VⅢ F相关抗原免疫光法检测：
操作：培养三天至四个星期内，在24 孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5 cm ×0。6 cm ，在盖玻片上点100μl 浓度为5.0
×105 / ml 的细胞悬液， 在37 ℃，5 %CO2 条件下培养4 h ，使细胞贴壁， 然后加入2ml
培养基继续培养。待内皮细胞生长至近融合状态时，用PBS 洗3 次，每次5 min ，然后加入丙酮，室温下固定10 min ，再用PBS 洗3
次，每次5 min ，干燥后加第一抗体———兔抗人Ⅷ因子单克隆抗体100μl（1 : 50 倍稀释），放入湿盒内37 ℃保温1 h
，同时以磷酸缓冲液替代一抗作阴性对照。用PBS 洗3 次，干燥后加FITC 标记的二抗———羊抗兔IgG ，放入湿盒内37 ℃保温1 h
，用PBS 洗2 次，再用蒸馏水洗一次，干燥后用50 %缓冲甘油封片。然后立即在荧光显微镜下观察，摄片。
理想结果：原代及传代培养的内皮细胞浆中有黄绿色的荧光着色，胞核呈黑绿色，整个细胞轮廓清楚。作为对照的内皮细胞片子中，偶见绿色斑点散发荧光，未见细胞轮廓。然后用rhTNFα造成细胞损伤及凋亡，并用药物干预。
