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微板及酶免自动化概述（一）

2021.7.02

2000年，迎接新千年之际我应邀撰写了《酶免试验的自动化与网络化》一文，介绍传染病原的酶免检测自动化分析。彼时正是PCR检测刚刚进入欧美的临床和血液筛查市场，大家关心的是蛋白免疫分析能否将被PCR替代、如何快速发报告等等。后来这篇文章在中国网络上广泛传播，成为大家了解这个领域的入门之参考。十几年过去了，当下的主题是“精准医疗”，而中国市场流传着免疫分析将被管式化学发光系统取代。受CAIVD之托，再次更新撰写酶免分析进展。本次，我把自己多年的研究与学习，富集知识、历史及业界动态一并综述，将主题细化，形成了本文题目，谨供有关人士针对精准医疗目标，利用微板技术发展高通量、高内涵、高分辨之大数据采集作为参考。

第一章酶联免疫分析技术
(Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)

1952年美国威斯康星大学的理查德·高德伯格(Richard J. Goldberg)首次发表了正确描述抗原-抗体反应文章，形成了抗原-抗体反应的“高德伯格理论” 这是现代蛋白免疫理论与应用的基础[1] 。

最早的基于抗原-抗体反应的免疫蛋白特异性检测技术，是建立于1960年的放射免疫分析技术（RIA）。美国纽约退伍军人管理局医院的所罗门·伯森(Solomon Berson) 和罗莎林·雅洛(Rosalyn Yalow，图1)最先发表了内源性血浆胰岛素的测定[2]。为此，罗莎林·雅洛独占了1977年诺贝尔医学奖的一半，以表彰她建立肽类激素的放射免疫分析技术。虽然，伦敦米德塞科斯医院的罗治·伊金斯(Roger Ekins)博士也在1960年发表了他的发现，利用饱和分析(saturation analysis)检测血浆的甲状腺素[3]，但并未有缘诺贝尔奖。

尽管免疫蛋白特异性检测技术的早期应用，采用了竞争性原理以便在均相反应体系(homogeneous reaction)下定性和定量测定未知物，但是为了洗涤移去、排除未结合的抗体或抗原来保证检测的特异性specificity、真实性fidelity，就必须将抗原或抗体固定到一个固体（如孔壁）上，这就是异相免疫分析逻辑的建立。瑞典乌普沙拉大学的Leif Wide和Jerker Porath在1966年发表了固相免疫技术(Solid-phase technique)原理[4]，这是人类认知能力的进步。

自60年代起放射免疫分析技术迅速发展，就已经开始采用亚克力手工制作的微板。1965年由美国的Cooke Labs(现在更名为Dynex Technologies)上市了亚克力注塑工艺的96孔微量滴定检测板Microtiter，以高通量来平衡复杂费时的操作。直到70年代初期，大多数放射免疫试剂基本上是由研究人员自己“家酿”的，并需要在特殊的放射防护实验室里操作。后来，德国Boehringer-Mannheim (宝灵曼)公司, 美国Abbott (雅培)公司及荷兰Organon Teknika (欧伽侬)公司等成为最早的放射免疫试剂制造商，提供初步标准化、经济合算的RIA试剂盒。

放射免疫分析（RIA）在80年代末期达到高峰并开始衰落(发展趋势统计见图2)[5]，是因为另外一项更简洁、更安全的技术出现和快速发展，这就是始现于70年代初期的酶联免疫技术(Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA) 。

酶联免疫分析（ELISA），是用酶标记替代放射物标记，并利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应的一种免疫技术。由于ELISA可用于几乎所有的可溶性抗原抗体的检测、没有放射性污染，避免了潜在的人体伤害，并由于酶催化底物显色有很强的放大作用而无需昂贵的测试仪器，这使得基于微板的酶联免疫分析成为临床检验、药物开发和生命科学等实验室最基本的工具。1971年，瑞典斯德哥尔摩大学的彼得·皮尔曼(Peter Perlmann) 和伊娃·尹格瓦(Eva Engvall)，荷兰Organon Teknika (欧伽侬)公司实验室的安童·舒尔茨(Anton Schuurs) 和宝科·范维曼(Bauke van Weemen)，以及法国巴斯德研究所的Stratis Avrameas等人分别独立地发表了辣根过氧化物酶HRP标记的应用文章，建立了酶联免疫分析方法[4]。

Organon Teknika (欧伽侬)公司最早在生殖内分泌领域商业化了血浆hCG、总雌激素、人胎盘催乳素等酶免试剂，这一时期产品在灵敏度方面还不能与RIA试剂媲美，所以尽管申请了美国ZLUS762120等知识产权，但直到80年代初期市场表现并不成功。

70年代初期在血液筛查开始的乙肝病毒检测，促进了ELISA技术及其相关设备的自动化的发展。在选择具有放射性危险的半自动RIA系统，或选择缓慢复杂的血球凝集滴度试验，或是操作明晰的ELISA技术，血液筛查市场选择了ELISA技术。

1976年Organon Teknika (欧伽侬)公司上市96孔微板的乙肝表面抗原ELISA试剂HEPANOSTIKA 得了高度成功，这是世界上第一个商业化的ELISA试剂盒（图3）。同年4月，德国临床化学学会(DGKC)向瑞典人皮尔曼和尹格瓦，荷兰人舒尔茨和范维曼四人颁发了德国科学大奖“Biochemische Analytik”(生化分析，图4)。当然遗憾的是，这个针对ELISA发明的颁奖，并没有影响到第2年的诺贝尔医学奖-RIA发明的评选。

导至ELISA试剂取代RIA试剂的真正推动力，是来自80年代初期单功能的自动化设备开发。这些设备包括，瑞士Hamilton(哈美顿)的Micromedics自动加样设备，芬兰LabSystems（雷勃）的多通道加样器, 酶标仪及洗板机，德国宝灵曼的全自动酶标系统。这些设备的自动化以及操作简便，使得许多内分泌激素测定和传染病检测由特别污染/废弃物管制的放射同位素科，可以转入到普通的实验室进行。此外，瑞典人皮尔曼和尹格瓦没有将ELISA申请ZL，而Organon Teknika (欧伽侬)公司后来虽然申请了，却没有独霸，而是ZL许可了超过100家公司，这也是普及ELISA的发展动力之一[6]。

从此，ELISA作为一种非放射标记的免疫分析技术开始在世界各地实验室成为常规的检测手段，不但为人类健康和疾病临床诊断、治疗监控提供特异性的数据，而且也触发了体外诊断(IVD)工业的形成。在2012年，商业化免疫分析市场已经达到了170亿美元的规模（见图5）[6]。许多临床化学家也发展成为临床免疫学家，酶联免疫分析技术是一项伟大的发明。

图5 2012年免疫分析市场规模与分化[6]

中国的免疫分析诊断工业起步于70年代初期。时任北京医科大学人民医院检验科主任的陶其敏教授（见图6），在1973年10月自行研制出中国第一套乙肝检测血凝法试剂盒，开启中国病毒抗原-抗体免疫检测时代。成立于1985年的北京北方生物技术研究所或许是中国最早的放免试剂生产商。1990年中国医学科学院基础所内分泌室陈克铨教授最早开发了96孔微板的hCG检测的ELISA试剂盒，用于早孕检查。1988年10月10日，解放军军事医学科学院基础医学研究所正式创建“北京四环生物工程制品厂“，并于1991年独家获得乙肝五项ELISA试剂的生产文号和新药证书，这是中国最早的用于传染病检测的ELISA试剂。

表1是2011-2015年五年间中国食品药品检定研究院对用于血液筛查的四项ELISA试剂盒进行批批检的数据表，仅这四项血液筛查的试剂，每年的年测试总量达5亿次，这意味着每年大约有5亿以上的人次，至少每人做一项检测。这个数字并不包括，采用发光免疫检测的临床市场（特别是进口产品），临床检测的总量应该不少于血液筛查的检测量。

表1 2011-2015年中国食品药品检定研究院对用于血液筛查的四项EIA试剂盒进行批批检的数据

人份

2011

2012

2013

2014

2015

HBsAg 检测总量

193,865,400

177,504,112

175,693,824

201,973,568

179,364,336

其中进口试剂总量

5,054,208

5,451,264

5,875,200

6,181,920

1,973,280

anti-HCV检测总量

113,947,648

111,195,456

111,196,976

125,726,208

125,126,592

其中进口试剂检测总量

5,876,640

5,421,600

5,849,200

5,861,280

4,167,840

anti-HIV检测总量

126,978,278

129,097,152

135,855,744

132,163,680

147,749,088

其中进口试剂检测总量

4,634,112

8,077,920

7,911,840

11,561,280

11,722,560

Syphilis检测总量

81,232,512

85,133,088

87,528,000

90,047,328

103,279,200

其中进口试剂检测总量

125,760

802,560

715,680

624,960

148,800

四项检测总量

516,023,838

502,929,808

510,274,544

549,910,784

555,519,216

其中进口试剂检测总量

15,690,720

19,753,344

20,351,920

24,229,440

18,012,480

毫无疑问，以上数据表明，中国是世界上最大的ELISA试剂生产国和消费国。

50余年来，基于96孔微板的ELISA技术已经成为各种实验室最基本的检测手段，蛋白免疫特异性分析为基本的临床诊断、治疗检测以及药物研发，提供了大量数据。

过去的50余年来，人们不断地试图对基于微板的ELISA技术的各个环节，进行创新、改进，以便将这项伟大发明的应用，提升到更新更高的水平。例如，在自动化平台上，新的或替代的ELISA形式正朝向微量化(miniaturized)或微流体(microfluidic)组件发展；微板的包被正在实现全自动化，以提高试剂的精密度；试剂盒组份正在”聪明化“(cartridge-based reagents)，以减少试剂试验的准备时间等等。在试验操作上，改进洗板自动化提高洗涤效率，以适应第4代高包被(high binding)的高灵敏度需要；采用发光底物来改进传统比色在高浓度(OD值大于2.0)检测的低分辨率，拓宽定量动态的线性范围；在固相载体上，使用磁珠或微粒，以减少包被蛋白与检测蛋白扩散(diffusion)距离，缩短了抗原-抗体结合平衡时间，还增加了多蛋白包被组合的可能性。

无论如何，微板作为N x 96个微试管处理单元，其设计本质就是批量、整体处理这些微试管，以便在复杂的试验过程中提高总体效率，这就是人们在不停地发展这项技术的原因。

毫无疑问，在精准医疗概念下，我们需要更细致、更大量的蛋白数据作为诊断信息，以支持精准治疗，因此，具有高通量(High-throughput screening，HTS)、高内涵(High-content screening，HCS)、高分辨(High-resolution screening，HRS)特征的基于微板的ELISA技术，将在蛋白和核酸分析方面出现新的发展。

下面，我们将分别以微板及酶免自动化的过去、现在进行全面综述，以展望未来的ELESA前景。

第二章微板
（Microplate）

1.微板发展进程
作为检测分析器皿，微板最早是由匈牙利医生、科学家和发明家 Gyula Takátsy于1951年手工制造而成。当时匈牙利流感疫情严重，需要找到了一种快速、经济和可靠的测试方法来鉴别流感病毒。采用当时的标准测试方法，需要很多试管进行系列稀释，过程繁琐，成本高并费时，且结果并不太可靠。Takátsy采用管挨着管、线性回路式进行布局，就可以对多个试管同时加入等量标本，大大地提高实验标本的处理通量，这就是8×12孔的96孔微板的由来。

最初商业化96孔微板是用亚克力注塑的，主要应用还局限在血凝抑制试验，由于便于系列稀释操作，使得微板在病毒和血清滴度测试中发挥主流作用。直到开始使用聚苯乙烯polystyrene注塑的微板作为蛋白吸附固相载体，才使得96孔微板在RIA和ELISA中成为核心作用。

图7 微板的商业化进程

经过50余年的开发，2:3矩阵形状的微板已经千姿百态、形式各异，以适应高通量的应用。从反应孔密度来分，已有6孔、24孔、96孔、384孔 (诞生于1992年)以及1536孔微板(诞生于1996年)，甚至3456孔微板(诞生于1996年)和9600孔微板(诞生于1997年)也在开发中。但受表面张力的影响，高密度384孔和1536孔微板，在加样、洗板等处理成为瓶颈，至今没有商品化试剂盒供应；而受液体蒸发的影响，超高密度的3456孔和9600孔微板的应用更加困难。但是，强大的高通量、高内涵的大数据需求，迫使人们持续追求高密度孔微板的处理解决方案（图7）。

此外，根据分析测试需要，微板在除了光学透射传统格式外，其他方面处理也在变化中。如，为了避免密集的孔间所产生的串扰(cross-talk)，采用荧光测试时就选择黑色板材；采用发光测试时就选择白色板材；当采用顶部荧光测试时，选择孔底实心不透的；而采用底部荧光测试时就需要孔底透明的。为了吸附蛋白、核酸，就选择聚苯乙烯材质并做表面处理增强结合量；为了避免吸附蛋白和核酸的长期存储，就采用聚丙烯、COP等疏水、保湿强的塑胶。表面涂层也是微板处理的经典手段，目的是降低非特异性结合，增强细胞组织培养固着等等。

在微板的发展史上，重要发明事件在下面编年表2中，由此可鉴，这是多么不一般的塑料板！

表2 微板重要发明事件编年表

年代	创新者	隶属机构	主要贡献
1951	Dr. G. Takatsy	N.I.P.H. Hungary	机加工的72/100孔亚克力微板
1952	Dr. G. Takatsy	N.P.H. Hungary	首款机加工的96孔V形底孔亚克力微板
1953	Mr. John Liner	Linbro Company	首款真空成型的96孔微板
1963/1964	Drs. Sever & Cooke	N.I.H. Labs USA	首款模塑的96孔微板
1965	Cooke	Cooke Labs USA	设立公司，使用亚克力及后来的聚丙乙烯制造96孔微板
1966	Dr. Knebel	Griener Labs	在欧洲首次生产96孔板
1968	Cooke	Cooke Labs USA	微板MicrotiterZL发布以及商标注册
1968/1969	未知	Falcon (now BD)	6孔PVC加热成型板诞生
1968/1969	N.A.	Dynatech Labs	Dynatech公司收购美国库克Cook Labs公司
1969/1970	Dr. Morningstar	Data Packaging Corp.	定制Microtiter酶标板塑模
1970	N.A.	Dynatech Labs / Data Packaging Corp.	成立著名的CoStar合资公司
1971	Cooke	N.A.	起诉John Liner，导至微板ZL宣告无效
1972	N.A.	Dynatech Labs / Data Packaging Corp.	二家的合资公司解散
1972	Dr. P. Cleveland	Univeristy of Minnesota	首次出现具有过滤管腔的微板
1974	Allister Voller & Ken Walls	London and CDC	ELISA试验上开始使用微板
1975	Greg Mathus & team	CoStar division of DPC	微板格式重新设计
1975	Griener Labs	Griener Labs	平底和U型底的8孔条微板
1976	未知	Falcon (now DB)	开始塑模生产96孔微板
1976/1980	N.A.	Corning, Nunc	Corning公司和Nunc公司进入96孔微板市场
1979	A. Thorne	Dynatech (Dynex)	可组合的单板条和板架Removawell™微板
1980	Dr. P. Cleveland	V & P Scientific	首款具有玻璃纤维滤芯GF discs的微板
1980	Dr. P. Cleveland	V & P Scientific/ Schleicher & Schull	首款96孔斑点印迹腔微板
1981	Kivosky et al	Millipore	机制96孔滤芯微板
1981	Dr. Cleveland	UCLA at San Diego	首款96孔滤芯微板ZL
1982	A. Thorne	Dynatech (Dynex)	首款有色（黑和白）微板
1983	A. Thorne	Dynatech (Dynex)	在欧洲发表了有颜色微板ZL
1983	Dr. M. Jolly	Pandex (now Iddex)	首款96孔滤芯底黑色微板
1984	Roy Manns	Meipec	设计首款无串扰信号的滤芯微板
1984	Roy Manns et al	Genemed Engineering	首个双件组合的滤芯微板ZL
1985	Roy Manns et al	Genemed Engineering	生产硝化纤维素滤芯微板
1985	Dr. P. Cleveland	V & P Scientific	首款有12孔滤芯板条的96孔微板
1986	Roy Manns	Genemed Engineering	接手微板开发
1987	Dynatech研发团队	Dynatech Labs	带有8孔和12孔板条的96孔微板
1987	Manns, Saunders et al	Polyfiltronics Ltd.	在英国的新公司负责滤芯微板
1987/1988	Dr. V. Matkovich	Pall Corp.	开发3层 96孔微板
1988	CoSar研发团队	CoStar	引进8孔滤芯微板条
1988	Barry Bochner	Biolog	首个邮票大小的微板
1990	Roy Manns et al	Polyfiltronics / Packard	首款96孔透明底微板
1990	Tom Astle	TomTech / Pfizer	带有Porex滤柱筛的24孔微板
1991	未知	Helix	首款864孔微板
1991	Richard Goodwin	Neuroprobe	首款具有细胞趋化分析腔的96孔微板
1991	Roy Manns	Polyfiltronics	首款玻璃纤维材料的微板
1992	Dr. G. Lennon et al	Lawrence Livermore	开发首款384孔微板
1992	Dr. Bochner et al	Biolog / Polyfiltronics	首款具有35mm玻片形式的48孔细胞培养微板
1992	Genetix研发团队	Genetix	第一款商业化384孔微板
1992	Roy Manns et al	Packard Instruments	96和24闪烁计数滤微板
1992	Richard Goodwin	Nueroprobe	具有可视滤膜的趋化分析腔微板
1992	Roy Manns et al	Pakard Instruments	底部发光分析96孔微板
1993	Millipore研发团队	Millipore	MultiScreen96孔PVDF滤膜微板
1994	Richard Goodwin	Nueroprobe	首款25ul低孔板和滤框ChemoTX系统
1995	Roy Manns/Dr. Seed	Polyfiltronics / AGTC	首款DNA深孔滤芯微板
1994	Roy Manns et al	Polyfiltronics	首款注模PCR微板
1995	Manns / Margolin et al	Polyfiltronics	首款注模384孔PCR微板
1996	Manns / Young et al	Whatman	首款1536孔微板
1995/1996	Manns et al	Polyfiltronics / MDC	首款96孔紫外透过微板
1996	Manns et al	Whatman / Aurora	首款3456孔纳米微板
1997	Dr. Knebel	Greiner Labs	首款注模1536孔微板
1997	Richard Goodwin	Nueroprobe	300ul ChemoTX系统
1997	Manns et al	Evotec / Whatman	首款96孔玻璃底微板
1997	Dr. K. Oldenburg	Du Pont	首款9600孔微板
1997	Dr. Knebel	Greiner Labs	首款方孔1536孔微板
1997	Genetix 研发团队	Genetix Ltd	首款圆孔1536孔微板
1997	Lipsky, Manns	Whatman	首次2mm 玻璃/PP-组合化学
1997	Dr. Knebel	Greiner Labs	首款透明底1536孔微板
1997	Dr. Knebel	Greiner Labs	首款小体积（20ul）96孔微板
1998	Polyteam	Whatman Group	首款深孔（400ul）384孔微板
1998	Dr. Knebel	Greiner labs	紫外透过384孔微板
1998	Dr. Smith et al	Whatman	装载树脂的生物分析板
1998	内部研发团队	Affymax / Whatman	首款864方孔微板
1998	内部研发团队	Affymax / Packard/ Whatman	首款864孔可视滤膜微板
1999	内部研发团队	CoStar	96孔滤芯微板
1999	内部研发团队	Millipore	一体化96孔滤芯微板
1999	内部研发团队	Whatman / Polyfiltronics	首款48孔5ml矩形微板

2.微板的SBS标准化
毫无疑问，微板作为一种开放的分析器皿，应用在实验的各个处理过程，如加样、混合、孵育、离心、洗板以及读数，标准化是统领各种处理的核心。感谢生物分子筛查学会(Society for Biomolecular Screening, SBS)于1996年在瑞士巴塞尔发布了微板的标准定义，1999年完整定义了微板全部几何尺寸。2003年提交给美国国家标准化组织（ANSI），ANSI于2004年颁布了包括96孔、384孔及1536孔微板标准(ANSI/SLAS 1-2004 至 ANSI/SLAS 4-2004)。微板标准（SBS）的制定，极大的促进微板以及相应的外围部件和设备的通用性和开放性的进一步开发，以便人们更好的利用微板开发ELISA试剂。

3.反应体系微量化
在过去的很长时间里，96孔微板在ELISA、CLIA、NAAT领域中被广泛使用。由于96孔微板有限的孔数量，迫使试剂研发者将多种蛋白组合在一个孔中，这样导至其灵敏度和特异性的下降且不能把多种蛋白真实性完全表现出来，这已成为公认的事实。近年来，人们正在384孔和1536孔微板上寻求大的突破。

由表3可见，高密度孔微板随着孔密度的增加，除了因微量化(miniaturization)可以更多减少试剂使用量而减少试剂的成本外（见表4），还可以大大缩短孵育时间以提高效率。高密度孔微板分析微量化有着诱人的前景(见表5)。越来越多的研究发现，高密度孔微板分析（如384或1536孔微板）的微量化，不仅能够获取同目前常用的96孔微板分析一样的精密性，并且能够明显提高分析的灵敏度[16][17][18]。

表3 三种不同微板在正常气压蒸发条件下工作时，其固相反应性能的比较

	1536孔-微板	384孔-微板	96孔-微板
典型反应体积	6.00 ul	25.00 ul	100.00 ul
反应表面积	17.79 mm2	41.76 mm2	94.00 mm2
抗原-抗体复合物浓度[Ag-Ab]	4.71 keq[Ag][Ab]	2.65 keq[Ag][Ab]	1.00 keq[Ag][Ab]
扩散距离（X）	0.80mm	1.70mm	3.50mm
扩散时间（X2= Ddif•t）	0.66/Ddif	2.89/Ddif	12.25/Ddif
孵育时间	4.00min	14.00min	60.00min