miRcroRNA转染流程
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。本实验室主要是质粒转染、miRcroRNA转染、慢病毒转染、药物转染、多肽转染等。
一. 实验材料及试剂
六孔板、CO2培养箱、EP管、酒精灯等；无血清培养基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC细胞等。
二、实验内容
1、当六孔板中MSC细胞密度达90％时，准备转染，将无血清培养基、MEM-α或DMEM取出复温并注意平衡好；
2、取出细胞，将培养基换成无血清培养基，放回孵箱培养；
3、取灭菌的EP管，按要求混好RNA（约100pmol/孔），每管250ul DMEM，混匀；
4、另取EP管，加入lipofectamine 2000（5 ul/孔）和MEM-α或DMEM（250ul/孔），轻轻混匀后室温静置5min；
5、将上述两个EP管混匀；
6、室温静置20min，将lipofectamine 2000-质粒混合液滴到六孔板中，500ul/孔；
7、将细胞放回孵箱培养，4h后换回含血清的完全培养基。
三、注意事项
1、转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素。
2、如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5mL无血清培养基。
3、在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
推荐
