氨基酸单向纸层析实验原理和步骤(2)
（4）滤纸：
层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。
不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同；
另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.01～0.4M的HCl处理除去金属离子）；
（5）室验室的温度和时间:
温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，影响固定相的体积；也显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例，层析必须在恒温条件下进行，某些对温度敏感的溶剂系统，最好不配制成饱和溶液。层析时间长Rf大。
（6）展开方式：
下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽,滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）Rf大，上行法Rf小；环行法（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。
（7）样品溶液中杂质：
如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品
2、仪器：(1)毛细管(2)电热吹风机(3)层析缸(4)层析滤纸
（5）小型玻璃喷雾器（6）铅笔、直尺等。
3、试剂：
（1）氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、组氨
酸标准品。
（2）溶剂系统：
正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；
（3）0.25%的水合茚三酮溶液。
四、实验步骤：
1、样品的准备：称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各1mg混合溶于10%异丙醇中。
2、滤纸的准备：取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5个点。
3、点样：用毛细管点样，中间的点混合氨基酸，两侧点四种标准氨基酸；每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触。
4、展层：
向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线，（高约1.5cm，约50－60ml溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，冷风吹干。
5、显色：
用喷雾器将0.25％茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显色。
五、实验结果与计算： 五、实验结果与计算：
1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；
2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf值。
3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。
