细胞组分的分析方法-2
4.rDNA片段的制备
(1)对所得重组质粒DNA进行SacⅠ酶切，反应体系如下：SacⅠ 4μl(约20单位)，质粒DNA 50μl(20μg)，10×缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl，pH7.5，50mmol/L MgCl2)10μl，灭菌重蒸水36μl。
(2)将反应后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳2-3h，在紫外灯下确定DNA片段的位置，从凝胶上切下相应DNA片段的凝胶块。
(3)将上述凝胶块装入透析袋中，一端扎紧，加入450μl 0.2×TEB(10mmol/LTris-HCl，pH7.5，1mmol/L EDTA)，排除气泡，封上另一端。放入电泳槽中进行电泳，300V电泳1.5h，反向通电1min。
(4)从透析袋中吸出溶液，再加450μl 0.2×TEB冲洗透析袋，两次溶液合并后以12000rpm离心15min，除去凝胶碎块。
(5)用酚、酚/氯仿、氯仿抽提后，加入2倍体积乙醇，沉淀DNA片段，再用70%乙醇洗涤并真空干燥，用TE溶解待用。
5.rDNA片段的生物素标记
本实验用的标记方法是缺口平移法(Nick-translation)。其原理是在未标记的DNA探针溶液中加一定量的DNaseⅠ和DNA聚合酶
Ⅰ以及生物素(或同位素)标记的三磷酸核苷酸。DNaseⅠ在DNA双链上随机切开若干个有3'-OH末端的单链切口，DNA聚合酶Ⅰ则利用标记的三磷酸核苷酸按5'
-3' 方向重新修补缺口，此新合成的DNA的两条链上均匀地被带上标记物。其标记方法如下。
(1)反应体系
10×生物素反应液：0.5mol/L Tris-HCl,pH7.5，50mmol/L MgCl2。
dNTP溶液：50mmol/L Tris HCl，pH7.5，每种dNTP的最终浓度为0.3mmol/L。
生物素化dUTP溶液：Bio-dUTP溶于50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，最终浓度为 0.3mmol/L。
DNA多聚酶Ⅰ溶液；浓度为3单位/μl，溶于0.1mol/L磷酸钠，50％乙醇，l mmol/L DTT混合液中。
DNaseⅠ溶液：浓度为0.1μg/μl，溶于10mmol/L Tris-HCl，pH7.5，l mg/ml 牛血清白蛋白混合液中。
(2)取dNTP混合液(无dUTP)5μl，10×反应液5μl，DNA 4.5μl(1μg)，Bio-dUTP 7μl，酶混合液5μl，重蒸水23.5UI。混合后反应60rain，加5rd终止反应液(0.25mo1/L EDTA，pH7.5)终止反应。
(3)加入2倍体积的乙醇，沉淀DNA。
(4)用70%乙醇洗涤3次，以除尽来掺入的Bio-dUTP。
(5)真空干燥之后，以重蒸水溶解DNA，待用。
6.对标记的rDNA进行检测
采用硝酸纤维素膜固相杂交的方法进行检测。
(1)将硝酸纤维素膜剪成合适大小的长条，在2×SSC(0.15mol/L NaCl，0.015mol/L柠檬酸钠，pH7.4，等于1×)中浸泡过夜。
(2)捞出硝酸纤维素膜，空气干燥。
(3)将标记后的探针进行适当稀释，95℃水浴加热2-5min，使DNA变性。
(4)将变性后的DNA探针马上冰浴10min。
(5)将探针点在晾干的硝酸纤维素膜上，每个斑点点4μl。
(6)晾干后，将点样的硝酸纤维素膜夹在滤纸中间，80℃烘烤2h。
(7)用0.01mol/L PBS，pH8.2洗涤3次，每次15min。
(8)将与胶体金相连的链霉亲和素用pH8.2的PB进行稀释，并将膜放入该液中，室温孵育60min。
(9)用0.01mol/L PB，pH8.2洗膜3次，每次15min。
10)显影。
A液(对苯二酚0.85g，柠檬酸2.55g，柠檬酸钠2.35g，水50ml)B液(AgNO3 93mg，水50ml)按1：1混匀为显影液。将膜浸泡在显影液中，避光显影至出现深色斑点。用25%海波定影1-2min。
四.原位杂交和杂交子的检测
1.原位杂交
(1)按电镜常规制片程序，将用K4M树脂包埋的玉米根、松根等材料进行超薄切片，将其捞在镍网上。
(2)将载有切片的镍网放在2×SSC液面上于700℃浸30min，以破坏rRNA的二级结构。 另取一些切片载网，先用1mg/ml RNase处理2h，用重蒸水彻底清洗。再转入2×SSC中，于70℃加热处理30min作对照。
(3)在Parafilm膜上滴25μl预杂交液(50%去离子甲酰铵，10%硫酸葡聚糖，0.05%变性鲑精DNA，2×SSC)，将切片漂浮在预杂交液上，放入保湿盒内，42℃预杂交1-2h，以防止非特异性杂交。
(4)将标记的探针加热至100℃，变性5min后马上放入冰水中，0℃冰浴10min。
(5)在预杂交液中加入变性的探针，终浓度约为0.5μg/ml，此液即为杂交液。
(6)将杂交液滴在Parafilm膜上，将预杂交的切片漂浮在杂交液上。
(7)杂交后用50%去离子甲酰胺洗两次，每次5min。
(8)载片镍网依次用2×SSC，1×SSC，0.1×SSC，重蒸水各洗两次，每次5min，空气干燥。
(9)杂交后的切片用3%BSA(0．1mol/L PBS配制)封闭5min。
(10)将切片漂浮在金标链霉亲和素上(金颗粒直径为10nm，1：20稀释)，于室温放置1h。
(11)用PBS洗3次，每次5min，空气干燥。
2.电镜检测杂交结果
(1)用1-2%醋酸双氧铀染色5min。
(2)重蒸水漂洗3次，每次5min。
(3)柠檬酸铅染色1min。
(4)重蒸水漂洗同(2)，空气干燥后电镜观察。
该实验的结果是，在玉米、松的染色体上有金颗粒分布，对照为阴性。
-
焦点事件
-
企业风采
