植物总RNA的分离
实验概要
认识真核生物RNA的组成及分离的原理；学习RNA提取过程中抑制RNA酶活性的方法。
实验原理
真核生物的RNA包括rRNA、tRNA和mRNA。一个典型的真核细胞约含有10-5~10-6mg的RNA，其中80-85%为rRNA，其余15-20%主要由各种低分子量RNA组成（如tRNA、核内小分子RNA等），细胞的RNA大多都与蛋白质结合在一起，但这种结合很容易在变性剂存在下打破。在经有机溶剂抽提后，用乙醇或异丙醇可将其从上清中沉淀出来。
RNA提取中要严格避免RNA酶的污染，因为RNA酶极稳定，通常的消毒方法难以将其灭活，而空气中细菌、真菌和操作者都有可能成为RNA酶的污染源。RNA酶污染会使分离的RNA大量降解。
对于rRNA和tRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，当总RNA分离出来后还能用电泳、密度梯度离心、层析等方法加以进一步分离纯化。而mRNA的分离将在后续实验中做到。
主要试剂
1. 异硫氰酸胍
2. CSB（柠檬酸/十二烷基肌氨酸钠/b-巯基乙醇）缓冲液
3. 2mol/L NaAc pH 4.0
4. 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
5. 异丙醇
6. 75%乙醇
7. DEPC H2O等
主要设备
1. 瓷研钵（组织捣碎机）
2. eppendorf离心管
3. 冷冻台式离心机
4. 液态氮
5. 剪刀
6. 一次性手套
7. 恒温水浴锅
8. 真空干燥仪
9. 紫外分光光度计
10. 凝胶电泳装置
11. 凝胶成像系统等。
进行RNA提出的所有器皿必须保证未受RNA酶的污染，玻璃、瓷器和金属耐热器皿应先以0.1%DEPC（二乙基焦碳酸盐）水溶液浸泡2hr，然后以铝箔包裹后在180℃烘烤过夜。使用新的塑料制品，并将其在0.1%DEPC中浸泡2hr并经高压蒸汽消毒30min。操作过程中还应严格避免外源RNA酶的污染。
实验材料
水稻幼苗，剪取幼芽。
实验步骤
1. 称取材料0.1g，剪成约2mm长段，加入液氮研磨成细粉状。
2. 加入0.2g异硫氰酸胍和2ml CSB缓冲液，继续研磨成匀浆。
3. 将匀浆转移至两个eppendorf管中，加入0.12ml NaAc，加盖后反复颠倒离心管20次。
4. 每管加入1ml酚：氯仿：异戊醇，混匀后剧烈震动10sec，冰浴15min。
5. 10，000g，4℃离心15min。
6. 小心将上层水相转移至新管中，注意不要吸动中间层。中间层富含蛋白质和DNA。
7. 加入等体积的异丙醇，混匀后置-20℃放置30min以沉淀RNA。
8. 10，000g，4℃离心20min沉淀RNA。
9. 弃上清，将RNA沉淀悬浮到0.5ml CSB溶液中，摇动溶液至RNA溶解。
10. 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇重新抽提一次，即重复4—8的步骤。
11. 离心后弃上清，沉淀用0.5ml预冷的75%乙醇漂洗一次。离心后弃上清，真空初步干燥沉淀。
12. RNA溶解在0.2ml DEPC水中，用紫外分光光度计测定260nm、280nm、及230nm波长的光密度，获得RNA的浓度和纯度。
注意事项
1. RNA的浓度C=A260×40×测定稀释倍数（ug/ml），纯RNA的A260/A280比值在1.7-2.0之间，若低于该值范围，表明有蛋白质污染，应重新进行有机溶剂抽提。若高于该范围，可能有异硫氰酸胍的残留或有核酸的严重降解，应重新进行醇沉淀的步骤。
2. 当前有很多生物技术公司生产分离RNA的试剂盒，如Trizol试剂，将异硫氰酸胍、CSB及苯酚混合在一起，按一定的体积与材料研磨后，即可通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA，可很方便地进行RNA的分离。
