磷酸化抗体芯片技术应用于寻找哮喘治疗新靶标
2018年2月7日，华盈生物合作伙伴上海中医药大学杨永清教授研究团队在完成的新研究中指出，临床有效的针刺抗哮喘治疗方法可显著提高金属硫蛋白-2 (MT-2)蛋白含量，其受体TG2是治疗哮喘的新靶标。该研究不仅在针灸效应物质基础研究方面取得了重大进展，更为哮喘病治疗药物的开发开启了大门。这一项突破性研究结果作为封面文章发表在2018年2月7日出版的顶级学术期刊《Science Translational Medicine》上。这是继2017年针灸治疗临床试验相关文章发表在国际期刊JAMA之后， CNS刊登的首篇针灸机理研究文献。
研究背景简介
哮喘是当今世界上常见的气道慢性炎症疾病之一，该病的发生与遗传因素、环境因素、呼吸感染等诸多因素相关。期间会有气管狭窄，导致后续肺阻力的出现，而舒张气管平滑肌细胞是缓解气喘，降低肺阻力的有效途径。临床上防治哮喘的药物主要有β2受体激动剂、抗胆碱药、糖皮质激素等。然而这些药物本身具有不用程度的副作用，而且长期摄入可以导致耐药性增加，使病情无法缓解。因此迫切需要开发新的哮喘治疗药物。
在中医界，几十年来年来运用针刺大椎、风门等穴位，可以显著改善哮喘患者呼吸功能。针刺具有多靶点效应，为挖掘针灸改善哮喘深层机制，杨永清教授研究团队将研究重点聚焦在了金属硫蛋白2（MT-2）上，MT-2属于金属硫蛋白家族，通常在气管上皮细胞和平滑肌细胞中保守表达。虽然已有报道证实金属硫蛋白在内毒素血症中能保护肺部的氧化应激，但尚未发现MT-2在哮喘研究方向的相关报道。杨教授研究团队以MT-2为研究起点，在其对哮喘的治疗应用方面展开了系统性研究，见图1。
演示文稿1.jpg
图1 技术路线
文献解读
MT-2：有效快速治疗哮喘，降低肺阻力
虽然临床针刺可以显著防治哮喘，但具体机制研究并不明确。为了首先理清哮喘发病机制，研究人员建立了OVA诱导大鼠过敏性哮喘模型，并分析了肺组织中MT-2蛋白表达水平，发现哮喘模型组中MT-2表达量下降超过50%。
金属硫蛋白水平的下调是不是哮喘发生的原因呢？
为验证这个推测，科研人员通过基因敲除手段验证了MT-KO小鼠哮喘的易发性，发现MT敲除小鼠比哮喘模型组有更高的肺阻力！应用重组MT-2蛋白进行反证的结果与之高度呼应：通过颈外静脉注射MT-2到哮喘大鼠体内可以显著降低肺阻力！同时，研究人员还将MT-2与FDA批准的哮喘治疗药物特布他林(TB）和氢化可的松(HC)进行了比较，发现0.1 μg/kg 的MT-2即可达到剂量高达550倍，甚至150000倍的传统哮喘治疗药物的效果。更让人不可思议的是，肺阻力在注射MT-2后的3分钟-8分钟就有显著下调，并且MT-2可以更加有效地降低乙酰胆碱（ACh）引起的气管平滑肌细胞（ASMCs）的收缩。如此的低剂、高效的MT-2让研究人员振奋不已！见图2。
图2.png
图2 MT-2能有效快速治疗哮喘
TG-2：MT-2结合受体发现
MT-2能有效治疗哮喘，是否需要通过结合下游受体发挥治疗效果？
研究人员通过共聚焦观察，发现MT-2定位到ASMCs细胞膜上。通过进行MT-2与ASMCs结合分析，证实存在受体介导MT-2和ASMCs的结合。为找到这个中间受体，科研人员采用传统的pull down + LC-MS/MS技术，鉴定到细胞膜中与MT-2结合的两个蛋白：Enolase-1和TG2。但在进一步的竞争性结合实验中发现，只有TG2的阻断抗体能抑制MT-2和ASMCs的结合，因此将研究重心锁定在MT-2结合受体TG2上。后续的系列细胞结合检测、共聚焦观察、分子动力学SPR分析结果均证实MT-2能在ASMCs细胞膜上结合受体TG2。
图3.png
图3 MT-2特异性结合受体TG2
MT-2—TG2：MT-2通过TG2舒张ASMCs
为进一步确证TG2对MT-2有效舒张ASMCs能产生影响，科研人员通过基因敲除手段分析了MT-2对TG2-KO鼠ASMCs的影响。发现一旦敲除TG2，MT-2对ASMCs的有效舒张也随之消失，且过敏性哮喘模型鼠更易发生哮喘！
MT-2通过结合TG2舒张ASMCs的内在机制是怎样的呢？
杨永清教授研究团队对MT-2可能参与影响的信号通路情况进行了系统性分析。面对细胞内复杂的信号通路，研究人员果断采用信号通路磷酸化广谱芯片PEX100（一次芯片实验即可完成31条信号通路磷酸化调变的全谱筛选），对用MT-2处理的大鼠ASMCs，以及对照组一同进行蛋白芯片检测。芯片筛选以及WB验证结果均显示MT-2很大程度的诱导Ezrin的磷酸化和MYPT1的去磷酸化水平。后续的Co-IP和SPR实验证实Ezrin是只能跟TG2共结合的蛋白。根据已有报道，Ezrin是一种细胞骨架蛋白，参与膜受体复合物的稳定。研究人员推测Ezrin可能通过调节TG2定位和肌动蛋白细胞骨架相互作用，最终助力MT-2舒张ASMCs，见图4。
图4.png
图4 MT-2通过TG2舒张ASMCs
TSG12：TG2激动剂的筛选与评价应用
鉴于MT-2通过TG2舒张ASMCs，TG2作为哮喘治疗新靶标，是否可以开发TG2激动剂来治疗哮喘呢？
杨教授研究团队与中科院上海药物研究所所长蒋华良早在2003年就成立“针灸中药效应联合实验室”，他们继续展开了紧密合作。利用分子对接等技术从6000个化合物中筛选TG2结合分子，并对排名前21的化合物逐一进行SPR分子动力学的验证工作，其中化合物TSG12展现出Z大强度的特异性结合TG2的能力。后续研究人员通过系统的细胞学和动物学实验，对TSG12进行了药效评价。结果显示：注入小鼠体内的TSG12主要在气管和肺部积累，其可以通过TG2促进ASMCs的舒张，有效舒展气道，降低肺阻力，从而达到哮喘治疗效果。在分子机制研究层面，研究人员以蛋白芯片筛选结果中MYPT1的去磷酸化为研究线索，通过WB实验证实TSG12的处理也可以诱导MYPT1Thr853的去磷酸化。已知MYPT1Thr853可以激活下游的MLCP,去磷酸化MLC，最终导致肌肉舒张。同时，研究人员也对MYPT1Thr853的上游进行验证分析，发现TSG12可以诱导RhoASer188的磷酸化和ROCKTyr722的去磷酸化水平。最终，研究人员将整个分子机制串联起来，TSG12可以抑制RhoA（已知RhoA的磷酸化可以抑制RhoA），通过调节RhoA-ROCK-MYPT1-MLC通路促进MLC去磷酸化，最终舒张ASMCs，见图5。
图5.png
图5 TSG12治疗哮喘表型和机制分析
最后，研究人员在哮喘模型动物中对TSG12的哮喘治疗效果做了进一步验证评价。证实具有TSG12能有效舒张气管平滑肌，显著降低肺阻力，具有“类针刺”作用效果。与临床防治哮喘药物β2受体激动剂相比，TSG12对TG2受体并没有产生脱敏影响，是一种效果极其优秀的哮喘治疗新药物，具有良好临床应用前景，如图6。
图6.png
图6 TSG12哮喘治疗评价
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
