用细胞染色技术分选细胞造血干细胞（HSC）和髓系祖细胞
实验概要
识别/分离骨髓祖细胞技术和定量RT-PCR技术的结合将是理解造血分子机制基础的一个功能强大的工具。本实验，我们描述了用于荧光激活细胞分类（FACS）技术的的小鼠骨髓祖细胞标准染色程序。
主要试剂
1. 1×的PBS/2％胎牛血清(FCS，无菌)
2. ACK缓冲液(41.45克NH4Cl，5克KHCO3，0.18克EDTA溶解于5升H2O中，储存在4°C，过滤，消毒)
3. 碘化丙啶(PI，Sigma公司)，制成500×的储备液(1.0mg/mL时)保存于通风柜中
4. 抗体(本文所提供的抗体用量仅仅是一个例子。每次使用一个新的批处理时，即使是相同目录编号的抗体也需要重新测定用量)
5. 三色(TC=藻红蛋白，PE-Cy5标记)标记的鼠抗CD3，CD4，CD8，CD19，B220和GR-1(Caltag公司)
6. 别藻蓝蛋白(APC)标记的抗C-KIT(BD Pharmingen公司)
7. FITC标记的抗CD34(BD Pharmingen公司)
8. 生物素化的抗SCA-1(BD Pharmingen公司)
9. PE标记的抗FcγRIII/II(eBioscience)
10. 链霉亲和素-APC-Cy7(Caltag公司)
11. FITC，PE，APC(BD Pharmingen公司)
12. TC和APC- cy7(Caltag)标记的抗B220抗体
主要设备
1. 5毫升带帽聚丙烯管(12×75毫米)
2. 聚丙烯50毫升锥形管
3. 磁珠(羊抗鼠IgG)和磁铁架(DYNAL生物)
4. 尼龙网(40-70微米孔径)
实验步骤
1. 收集细胞
1) 收获骨髓细胞(骨髓)和脾细胞，在1×PBS/2％FCS在50 ml锥形管中重悬浮；
2) 1300rpm减速离心5分钟；
3) 弃去液体；
4) 加入500μL 的ACK缓冲液，冰浴或室温下用吸管小心吹打1-5分钟(直到液体清亮)；
5) 加入40毫升1×PBS2％FCS，混匀；
6) 1300rpm减速离心5分钟；
7) 悬浮细胞如下(建议在染色前后使用尼龙网过滤单细胞悬液，以避免堵塞流式细胞仪)：
每个小鼠的骨髓细胞，在5毫升管中悬浮于100μL 1×PBS / 2％FCS中(依鼠的数量相应增加)。每个小鼠的脾细胞悬浮于350μL 1×PBS / 2％FCS。
2. 骨髓细胞染色
1) 加入3μL抗CD3-TC抗体，2μl抗CD4 –TC抗体，2μl抗CD8a-TC抗体，2μl抗CD19 –TC抗体，3μl抗Ly-6G (Gr-1)-TC抗体，3μl抗CD45R (B220)-TC抗体；
2) 冰浴黑暗条件下混合孵育30分钟；
3) 用3ml的1×PBS/2%FCS洗两次；
4) 如有实验有必要进行谱系消减，可进行如下操作，如无必要则略过4、5两步，直接进行第6步操作：
a. 骨髓细胞重悬于100μl的1×PBS/2％FCS，添加磁珠70μL；
b. 管在4℃，黑暗条件下旋转30分钟；
c. 加入4.5毫升1×PBS / 2％FCS，混匀；
d. 将管置于磁架上，室温下处理2分钟；
e. 用巴斯德管将液体移到新的管中(如需过夜，把液体置于15-20毫升1×PBS / 2％FCS，4°C黑暗保存)；
f. 1300rpm减速离心5分钟。
5) 于100μl的1×PBS / 2％FCS中重悬骨髓细胞；
6) 加入5μl抗CD34-FITC抗体，3μl抗FcγRIII/II-PE抗体，2μl抗CD117 (c-kit)-APC抗体和2μl抗Sca-1 (Ly-6A/E)-biotin抗体；
7) 混合并在黑暗条件下冰浴孵育30分钟；
8) 用3ml的1×PBS/2%FCS洗两次；
9) 于100μl的1×PBS / 2％FCS中重悬；
10) 添加2μL链霉亲和素-APC-Cy7；
11) 混合并在黑暗条件下冰浴孵育30分钟；
12) 用3ml的1xPBS/2%FCS洗两次并重悬细胞，其密度在 5×107/ml为最佳；
13) 加入碘化丙啶染色死细胞(终浓度为2μg/ml)；
14) 黑暗冰浴保存直至用于实验。
3. 脾细胞染色(我们使用单色流式细胞仪补偿控制)
1) 等分脾细胞至7支试管(每管50μL)，分别标示为＃1-＃7；
2) 每管分别加入以下的抗体：#1不加； #2加入PI(终浓度2μg/ml)；#3加入1μl抗B220-FITC抗体；#4加入1μl抗B220-PE抗体；#5加入1μl抗B220-APC抗体；#6加入1μl抗B220-APC-Cy7抗体；#7加入1μl抗B220-TC抗体；
3) 混合并在黑暗条件下冰浴孵育30分钟；
4) 用3ml的1xPBS/2%FCS洗两次；
5) 于500μl的1×PBS / 2％FCS中重悬(除#2外都不加PI)。
