九大测序平台对比（一）
1.Sanger
2.454
3.Solid
4.HiSeq2000
5.Helicos
6.DNA Nanoball array
7.The PacBio RS system
8.PGM
9.MiSeq
sanger
企业：Life Technology
推出时间：1977年发明，1986年第一台商业化测序仪
主流型号：3730XL
样品要求：PCR产物：浓度≥50ng/ul 体积≥10ul；质粒：含量≥5ug；菌液：体积≥1ml。
测序原理:
双脱氧链终止法：Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
文库制备:无需建库，提供质粒、菌液、PCR产物等均可以
模板制备:PCR扩增
读长:500-1000bp
测序通量:
四种测序方式的每天通量：
短片段测序36cm36min500bp 1,728,000bp/day；
快速测序36cm60min700bp 1,440,000bp/day；
标准测序36cm90min800bp 1,113,000bp/day；
长片段测序50cm120min1100bp 1,002,000bp/day。
(36cm指毛细管长度，36min指一次反应时间，500bp指一个反应的读长；)
时间/run:36 min-2 hours
碱基精确度:99.999%
变异检测能力(DNA重测序方面):
heterozygous insertions and deletions,microsatellite, SNP, AFLP, T-RFLP,and LOH analyses
AFLP：扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism),；
T-RFLP：限制性片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism）；
LOH analyses：杂合性缺失（Loss of Heterozygosity）；
成本:$95,000 per machine, about $4 per reaction, 800bp per reaction,
数据格式:*.bcf ； *.abl
分析软件:
数据收集软件Data Collection v2.0 (随机提供)
Manages your instrument setup, controls instrument
operations, allows real-time data visualization, and performs
diagnostics. New features include:
- Auto-analysis with GeneMapper® v3.5 and SeqScape® v2.1
- FDA 21CFRpart 11 compliance (for US customers)
- Flexibility to use any choice in dye set option
- Additional optimized sequencing run modules covering more applications
序列分析软件Sequencing Analysis v5.1
Designed to base-call; assign quality values; trim, display, edit and print DNA sequencing data using the KB basecaller
序列拼接和比较基因分析软件Seqscape® v2.1
Provides everything you need to perform resequencing applications such as VariantSEQr™ Resequencing System
自动化基因片段分析软件GeneMapper® v3.5
Enables configurable, automated allele calling -- a
plus for high-throughput genotyping and includes tools for SNPlex™ data
analysis
SNP分型数据管理软件BioTrekker™ v1.0 (optional data-mining tool)
Provides a fast, powerful way to search for, retrieve, and manage millions of genotypes
优点:测序金标准，读长长
缺点:通量低，成本高
经典案例:Sanger测序属于测序技术的金标准，文章众多
备注:鉴于测序本身方法的局限，测序引物后10bp～40bp无法保证准确
454
企业: Roche
推出时间: 2005年
主流型号: Genome Sequencer FLX Titanium（2008年推出）
样品要求: 5 μg of DNA，浓度≥300 ng/μL
测序原理：焦磷酸测序
在测序时，使用了一种叫做“Pico
TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
文库制备：Fragment(300-800 bp), Mate-pair
模板制备：微乳液PCR
读长：400bp
测序通量：0.4-0.6 Gb/run
时间/run：10 hours
碱基精确度：Q20读长为400个碱基
变异检测能力(DNA重测序方面：SNP, Indel, SV, CNV
成本：仪器$500,000/台，测序$5,600 per whole plate
数据格式：Raw data：SFF格式
分析软件：GS De Novo Assembler软件；GS Reference Mapper软件；GS Amplicon Variant Analyzer软件
优点：突出优势是读长长，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对。
缺点：无法准确测量同聚物的长度，所以检测插入缺失突变的误差率高；通量小且费用高。
经典案例：1.Complete Khoisan and Bantu genomes from southern Africa.Schuster SC et al. (2010) Nature 463(7283): 943-7.
(更多详见https://www.roche-applied-scienc ... ng/genome/index.jsp)
备注：特别适合从头拼接和宏基因组学应用，多用于新的细菌基因组。对重测序来说太贵，不适合
Solid
企业: Life Technology(2008年，ABI与Invitrogen合并为Life Technology公司)
推出时间: 2007年
主流型号: Solid™4.0（2010年推出）
样品要求:
• Fragment文库10 ng-5 μg
•Paired-end文库10 ng-5 μg
•Mate-paired文库5 μg-20 μg
测序原理: 边连接边测序
测序引物与接头可以互补杂交，其5‘端可与和邻近序列互补的寡核苷酸相连。八聚体寡核苷酸可竞争性与引物相连接（该寡聚体的第四位和第五位为荧光标记位点）。当其标记颜色被读取后，即将连接上的寡核苷酸在第五位和第六位之间切断，以移除标记，进行下一轮反应，以此依次循环。在第一轮反应中，可以得到确定的碱基位点为：4、5、9、10、14、15位碱基等。重复该反应过程，偏移一位碱基，使用较第一轮少一个碱基的引物进行反应，可以确定的碱基位点包括：3、4、8、9、13、14等，如此往复，直至偏移至引物的第一个碱基（即待测序列0位点碱基）。由于该位点碱基已知，可通过读取的荧光颜色得知位点1的碱基类型，然后，又以位点1碱基荧光颜色推知位点2的碱基类型，依此类推，直至整个序列读序完成。
文库制备:
• Mate-paired 文库 (插入片段 600 bp to 10 Kb)
• Paired-end 文库
• Fragment 文库
模板制备: 微乳液PCR
读长: 2*50 bp
测序通量: 100-120 Gb/run, 12G/day
时间/run: 7~12 days
碱基精确度: 原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖深度时的准确度可以达到99.999%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP, Indel, SV, CNV
成本: 仪器$495,000/台，测序$6000/100Gb
数据格式: Raw data: *csfasta和*quel；比对输出格式：BAM/SAM。
分析软件: 分析软件：Bioscope,比对后格式有很多第三方软件支持
优点: 高准确性，每个DNA碱基检测2次，增加了序列读取的准确性
缺点: 运行时间长，检测碱基替换突变的误差率高
经典案例:
SOLiD测序技术仅在DNA应用发表的文章共60篇，包括发表在Science/Nature及其子刊上的高水平文章15篇，其中de nove
sequencing文章3篇，targeted resequencing文章26篇，whole genome
resequencing文章31篇。SOLID在RNA和表观等文章应用也同样广泛。
备注: 行业领先的准确性实现了重要的生物变异检测，适合全基因组重测序、定向重测序和全转录组分析等应用。
HiSeq2000
企业: Illumina
推出时间: 2010/1/1
主流型号: Illumina HiSeq2000
样品要求: 6ug/sample,无RNA、蛋白污染，无降解，OD260/OD280=1.8-2.0
测序原理: 边合成边测序
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。This
technology attach random fragment of genome DNA to optically
transparent surface.And by extention bridge amplification of the DNA
fragments,it create a flow cell with > 10 million clusters, each
containing ~1,000 copies of same template. Then sequence by synthese
using four kind of terminal-closed base with different fluorescent mark.
This technology assures the high accuracy and one by one base
sequencing, avoids special mistakes of sequence and can be applied for
repeated sequence and homopolymer.
文库制备: Fragment, Mate-pair (200bp-40kb)
模板制备: 桥式扩增
读长: 50SE,91PE,101PE 等
测序通量: 25G/day
时间/run:
91/101PE, 8-10 days ;
50SE, 3 days;
150PE, 15 days;
总体来说，策略不同，时间也有差别
碱基精确度: Q30%≥80%；Q20%≥90%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP、Indel、SV、CNV
成本: $690,000 per machine , $6000 per human genome sequencing(30X)
数据格式: 测序结果：*.fq;比对：*。SOAP/*.BAM/*.SAM;变异：*.gff
分析软件: GenomeStudio或者第三方软件包；自主选择
优点: 通量大，测序方式灵活，分析软件多样化
缺点: 在成本上目前高于第三代测序，样本制备过程复杂，样本要求相对 较高。
经典案例: Initial genome sequencing and analysis of multiple myeloma.Chapman MA,et al.Nature. 2011 Mar 24;471(7339):467-72.
Cytoplasmic intron sequence-retaining transcripts
can be dendritically targeted via ID element retrotransposons.Buckley
PT,et al.Neuron. 2011 Mar 10;69(5):877-84.
Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.Edgren H,et al. Genome Biol. 2011 Jan 19;12(1):R6.
Genome-wide association mapping to candidate
polymorphism resolution in the unsequenced barley genome.Cockram J,et
al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 14;107(50):21611-6. Epub 2010 Nov
29.
MHC class II transactivator CIITA is a recurrent
gene fusion partner in lymphoid cancers.Steidl C, et al.Nature. 2011 Mar
17;471(7338):377-81. Epub 2011 Mar 2.
Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.Navin N,et al.Nature. 2011 Apr 7;472(7341):90-4. Epub 2011 Mar 13.
备注: 是目前市场上最主流的测序仪器，demo case众多；另外，The additional
benefit is experimental flexibility- applications that require different
read lengths can be run on each flowcell – an example is that a whole
genome sequencing and de novo sequencing study (eg. Of human and
microorganism) could be run on one flowcell at 2 x 100bp reads, and the
other could be running ChIP-seq and gene expression samples at 1 x 50bp
read length. Each flowcell is controlled independently; hence, a run can
be started/stopped independent of the other.
