用流式细胞仪分析利什曼病狗结肠细胞

2018年7月13日 13:41:22 来源: 互联网
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实验试剂

磷酸盐缓冲液(PBS – NaCl; KH2PO4; Na2HPO4和蒸馏水)

HBSS

不完全和完全介质(小牛血清) Roswell Park Memorial Institute (RPMI)

肝素钠钠盐,zui低99.5%滴定度,SIGMA-ALDRICH®

Ⅱ型胶原酶(Sigma#S-7900)

BSA(牛血清白蛋白)

Azida 2mM

实验设备

剪刀

钳子

培养皿

1.5,2.0,15和50mL试管

热孵化器(振荡器)

细胞培养离心机(Thermo Scientific multifuge X3R)

巴斯德吸管

实验步骤

1.除去结肠穿孔活检分离固有层细胞,在无菌培养皿中用不完全介质(RPMI)彻底清洗整个结肠清除粪便,将结肠片段转移到另一个含有10mL完整的介质的培养皿中,置于冰上。

2.用小镊子,手术剪除去结肠片段中的脂肪是细胞高效分离的关键步骤。

3.将样品放在无菌培养皿中缓慢搅拌10分钟,用巴斯德吸管取出上清液并弃掉,这个过程重复六次。

4.将组织碎片转移到含10mL培养液(DTT)的培养瓶中,37℃,震荡30分钟(120RPM),弃掉培养液,这一步持续30分钟。

5.加入10mL洗涤液,37℃((HBSS/HEPES)震荡10分钟(120RPM),洗去组织碎片中的DTT。

6.关键的一步:从结肠组织中的除去胶原蛋白这个过程是必不可少的。

7.这一步后,组织碎片中加入10ml胶原酶溶液,37℃摇轻轻振动筛(120RPM)45分钟。

8.45分钟后吸取出胶原酶溶液上清,转移到 Falcon® 15mL试管中。在4℃离心上清10分钟(1400RPM),加入0.5μL完全介质重悬浮,置于冰上。所有这些步骤必须重复四次。

9.细胞放在一个 Falcon® 15mL试管中,加入9ml蒸馏水溶解红细胞,10秒后加入1mlPBS中和这一步。之后4℃离心10分钟后(1400RPM),用0.5μL完全培养基重悬浮颗粒。

10.使用 Neubauer相机分析10μL样本中细胞数量,细胞数量应校准到1×107细胞/ ml。细胞可以阻断阴性利什曼犬血清,置于冰上至少20分钟。

11.利用台盼蓝染料(0.4% (wt/vol) in HBSS)鉴别细胞活力。这个反应是基于事实,除非膜损坏台盼蓝不与细胞相互作用。

12.稀释抗体浅标记ADS,胞内标记物在透化性缓冲溶液内。

13.将浓度1×107个细胞/ mL细胞悬液(20μL)放于96孔U型底板(Limbro Biomedicals® 175, Aurora, OH, USA)在细胞表面加入抗体。

14.将96孔板冷藏15分钟,之后每孔加入150μL预冷的 PBS, 4ºC(1300RPM)离心10分钟,弃掉上清。加入2%的甲醛200μL固定细胞。

15.将细胞加入到流式细胞仪管(荧光激活细胞),避光储存在冰箱中。

16.移去上清液胞内标记物,加入150μL PBS-w, 4ºC1300RPM离心样品10分钟,再次移出上清液。新增的透化性缓冲液(150μL);慢慢的混合样品,室温环境下保持10分钟。再次离心10分钟(4℃,1300RPM),除去上清液。

17.加入细胞内抗体包括亚类室温下孵育40分钟,加入透化性缓冲液(150μL),离心样品去除上清液。这个过程可以重复一次。

18.加入150μL PBS-W重悬细胞,离心去除上清液,加入200μL 2%的甲醛将细胞移至流式细胞仪管,避光储存于在冰箱中。

19.用流式细胞仪分析细胞。激光发光在488nm(FACSVantage®, Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA)。

20.评估结肠固有层细胞单核细胞表型的固有层细胞数量,两种不同的形式表达,一个给定的表型标记的细胞百分比(%),用细胞和亚型对照终止,具有双峰分布和几何平均荧光强度(MFI)。后者方法用单峰分布表型标记的半定量表达。平均荧光强度和频率的基础上,三色流式细胞仪优化用于狗结肠亚型单核细胞表型。分析细胞应侧重于亚群细胞的组成,这些细胞是:CD4,CD4FOXP3,CD8,CD11b,CD11c,TLR9,TLR2,CD14和甘露糖。这为比较狗利什曼病粘膜的各种临床状态提供了一个机会。


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