杜氏利什曼原虫检查

2019.4.17

实验概要

第一节杜氏利什曼原虫 Leishmania donovani

一、目的要求

1.掌握杜氏利什曼原虫无鞭毛体的形态特征，

2.熟悉杜氏利什曼原虫前鞭毛体的形态。

3.了解传播媒介白蛉。

二、实习内容

大体标本玻片标本视频 1.无鞭毛体 (染色标本)2.前鞭毛体(染色标本)

（二）玻片标本观察

1.无鞭毛体 (染色标本) (图2-5)

取感染了杜氏利什曼原虫的田鼠脾脏作涂片，固定后经姬氏染色制成标本。先用低倍镜观察，识别正常巨噬细胞、感染的巨噬细胞以及破损的巨噬细胞的核。换高倍镜，找到含有无鞭毛体的巨噬细胞，可见细胞内的无鞭毛体呈许多蓝紫色的小点。再换油镜观察，可见视野中满是由于巨噬细胞破裂而散在的无鞭毛体及巨噬细胞核。无鞭毛体呈椭圆形或圆形，大小为（2.0-5.7）μm×（1.8-4.0）μm。细胞质为浅蓝色，胞质中有紫红色的核及动基体，核大而圆，动基体为杆状，位于虫体的一端。

2.前鞭毛体(染色标本) (图2-6)

取人工培养的前鞭毛体制成涂片，固定后姬氏染色。油镜观察，虫体呈长梭形，长度为无鞭毛体的5倍以上。体前端稍钝，后端尖，胞质淡蓝色或淡红色，核紫红色，圆形，位于虫体中央。动基体紫红色，细小杆状；基体在动基体前端，点状，在体前端，由此向前伸出一根游离鞭毛。

思考：杜氏利什曼原虫无鞭毛体的形态结构

三、视频观察：

1.前鞭毛体活标本人工培养标本（见技术操作）。可见很多前鞭毛体聚集成菊花状，鞭毛自由摆动。(视频2-3)

2.传播媒介（白蛉）

雌性白蛉叮咬黑热病人时，血液或皮肤内的含无鞭毛体的巨噬细胞进入白蛉胃内，无鞭毛体发育为前鞭毛体，并以纵二分裂繁殖，数量大量增加，前鞭毛体逐渐向白蛉前胃，食道和咽部移动，一周后大量聚集在口腔及喙，当白蛉叮咬健康人时，虫体随白蛉唾液进入人体。

四、技术操作

1.穿刺检查无鞭毛体

（1）髂骨骨髓穿刺：病人侧卧，暴露髂骨。根据患者年龄大小，选17～20号带针芯的干燥无菌穿刺针，局部消毒后从髂前上棘后25px刺入，至针头触及骨面，慢慢地钻入骨内约0.5～25px，拔出针芯，接上注射器，抽取骨髓。骨髓涂片，干后用甲醇固定，瑞氏染色或姬氏染色，油镜检查无鞭毛体。

（2）棘突骨髓穿刺：病人侧卧或跨坐椅上，暴露椎骨棘突。选最明显棘突，局部消毒后由棘突尖垂直刺入骨髓腔，5岁以下者进针0.3～25px，5岁以上进针1.0～37.5px，拔出针芯，接上注射器，抽取骨髓。涂片染色方法同上。

（3）淋巴结穿刺: 一般在腹股沟进行。局部消毒后，左手捏住淋巴结，右手持6号针头刺入。因淋巴结内有压力，淋巴结内组织液可自行进入针内。稍待片刻，拔出针头，接上注射器，将针头内组织液涂片，同上法染色。

2.前鞭毛体培养法

(1)NNN（Novy， MacNeal， Nicolle）培养基配制琼脂14g，氯化钠6g，加双蒸馏水100ml，煮沸，充分溶解后分装试管，每管3～5ml，用棉塞紧塞瓶口。高压灭菌，待冷却至48℃时，每管加入培基1/3量的无菌脱纤维蛋白兔血，混匀后斜置冷却成斜面。每管加0.2～0.3ml洛氏液，使斜面上有一薄水层。此时，以无菌橡胶塞取代棉塞，以防水分蒸发。置37℃温箱培育24h，确认无菌后，即可使用。

成分任氏液洛氏液台氏液体生理盐水两栖类用哺乳类用哺乳类用两栖类哺乳类NaCl6.59.08.06.5~7.09.0KCl0.140.420.2——CaCl20.120.240.2——NaHCO30.200.1~0.31.0——NaH2P040.01—0.05——MgCl2——0.1——葡萄糖2.01.0~2.51.0——蒸馏水均加至1 000m1

(2)接种培养方法接种前，每管适量加青、链霉素。取病人骨髓、肝、脾、淋巴结穿刺物或皮肤活组织刮取物，与少量Locke氏液混匀，接种于NNN培养基中，置20℃～25℃温箱培养。一般7～10天后才显著生长。此时可取培养液涂片检查。也有2～3周始查见前鞭毛体的，所以接种后应连续培养观察1个月左右，再确定结果。

（3）注意事项

① 涂片用的载玻片须洁净无油污。

② 前鞭毛体生长与温度密切相关，须控制适宜的培养温度。

③ 配制培养基、接种和检查培养情况时，全程均应是严密的无菌操作。

思考：杜氏利什曼原诊断有哪些方法？

五、作业（绘图并标注内外结构）

1.无鞭毛体

2.前鞭毛体

实验步骤

四、技术操作

1.穿刺检查无鞭毛体

2.前鞭毛体培养法