IEF分离蛋白质
实验概要
等电点聚焦电泳（IEF）就是在电泳胶中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质在此体系中泳动时，不同的蛋白质即聚焦于与其等电点相当的pH位置上，电聚焦的优点是：有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开，由于IEF可使用超薄胶，并且其工作原理是建立在蛋白质等电点的差异上，因此分辨率极高，其与SDS－PAGE进行双向电泳的结果最多可以给出105以上的信息，是目前蛋白质组学研究的主要手段；一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄；由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其电点，很稀的样品也可进行分离；可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01pH单位。电聚焦技术的缺点是：一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，二 是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。本部分实验即要求掌握最基本的IEF原理及具体操作，以适应后基因组时代的研究要求。
主要试剂
样品提取液（8M尿素、2％非离子型去污剂NP－40、2％Ampholin，pH3.5-10、2％DTT）
胶母液 （30％的29/1的Acr/Bis），两性电解质
阳极缓冲液 1M磷酸
阴极缓冲液 1M氢氧化钠
固定液（10％的三氯乙酸、1％的磺基水杨酸）
染色液（35％乙醇、10％冰醋酸、0.15%考马氏亮蓝R250）
脱色液（35％乙醇、10％冰醋酸）
主要设备
高压电泳仪、IEF槽、离心机等
实验步骤
1. 样品提取
1) 1ml原核表达细胞液离心取沉淀
2) 沉淀用100ulIEF样品缓冲液裂解，离心取上清
2. 制胶
1) 安装超薄胶装置
2) 依次加入下述试剂
胶母液 2ml
尿素 8M /脱气
NP－40 0.2ml
两性电解质 2ml
10%过硫酸胺 50ul
TEMED 5ul
3) 倒胶
3. 电泳
1) 预电泳胶凝固后，拆卸制胶装置，将胶连同支持膜一起置于水平电泳槽上（要求，电泳槽面板上首先被液体石蜡浸润，在凝胶支持膜与电泳槽面板间无气泡）。
2) 将分别被阴阳极缓冲液浸润的电极条置于胶面上将与阴阳电极接触的部位，盖上电泳槽罩子，连通电源，200V预电泳10min。
3) 电泳，将薄棉纸剪成小块，轻轻置于预备点样的胶面上，取10－15ul样品液，点于薄棉纸上，盖上罩子，连通电源进行电泳
4) 电泳参数
200V 30min，400V 30min，800V4hr
4. 染色
1) 固定，将电泳完的胶连同支持膜放置于固定液中，10min.
2) 显色，50℃下，将胶与支持膜放置于染色液中，显色，直至条带出现。
