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蛋白质的分离实验——IEF（等电点聚焦电泳）法

2019.3.28

实验方法原理	凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
实验材料	蛋白质
试剂、试剂盒	胶母液磷酸氢氧化钠三氯乙酸磺基水杨酸冰醋酸考马斯亮蓝
仪器、耗材	高压电泳仪 IEF槽离心机
实验步骤	一、样品提取 1. 1 ml 原核表达细胞液离心取沉淀。 2. 沉淀用100 ul IEF样品缓冲液裂解，离心取上清。二、制胶 1. 安装超薄胶装置 2. 依次加入下述试剂（1）胶母液 2 ml （2）尿素 8 M/脱气（3）NP-40 0.2 ml （4）两性电解质 2 ml （5）10%过硫酸胺 50 ul （6）TEMED 5 ul 3. 倒胶三、电泳 1. 预电泳胶凝固后，拆卸制胶装置，将胶连同支持膜一起置于水平电泳槽上（要求：电泳槽面板上首先被液体石蜡浸润，在凝胶支持膜与电泳槽面板间无气泡）。 2. 将分别被阴阳极缓冲液浸润的电极条置于胶面上将与阴阳电极接触的部位，盖上电泳槽罩子，连通电源，200 V 预电泳10 min。 3. 电泳，将薄棉纸剪成小块，轻轻置于预备点样的胶面上，取10~15 ul 样品液，点于薄棉纸上，盖上罩子，连通电源进行电泳 4. 电泳参数：200 V，30 min；400 V，30 min；800 V，4 hr。四、染色 1. 固定，将电泳完的胶连同支持膜放置于固定液中，10 min。 2. 显色，50℃下，将胶与支持膜放置于染色液中，显色，直至条带出现。展开