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琥珀酸脱氢酶活力测定方法简介

2022.4.25

  1、硫酸甲酯吩嗪(PMS)反应法

  琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体,如与PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐),DCPIP(2,6-二氯酚靛酚)等发生反应催化琥珀酸的氧化,而借助这些中间产物的颜色变化,通过分光光度计检测即可加以定量反映,其反应式为:①Succinate+PMS→Fumarate+PMSH2;②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。DCPIP呈蓝色,标准的吸收光谱在600nm处,这种色泽可因其还原而渐次变淡,从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比,测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被还原,即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化,来计算SDH的活性。SDH活性计算:(标准-测定)/标准=μmol/min/mg。

  2、铁氰化钾[K3Fe(CN)6]还原法

  以铁氰化钾[K3Fe(CN)6]和琥珀酸钠为底物,使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6],K4Fe(CN)6再与Fe3+作用生成普鲁士蓝,在700nm波长测定吸光值,以检测普鲁士蓝之生成量,作为琥珀酸脱氢酶的还原力,吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。

  3、TTC(氯化三苯四氮唑)法

  无色TTC(2,3,5-氯化三苯基四唑)作为人造受氢体,它在细胞呼吸过程中接受氢,还原成三苯基甲膳(TF)。后者以红色晶体的形式存在于细胞内,采用有机溶剂(如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等)进行萃取。萃取液测定485nm吸光度后,以TTC还原量表示脱氢酶活性,根据标准曲线计算TF生成量,进而求出TTC-脱氢酶活性。

  4、MTT法

  MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT,同时在细胞色素C的作用下生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazana),经异丙醇作用颗粒溶解显色。在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比,因此可根据光密度570nm处OD值推测出活细胞的数目。

  5、NBT(氯化硝基四氮唑蓝)法

  NBT易溶于水,呈淡黄色,以NBT为受氢体,接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢,进而形成紫蓝色的沉淀,于反应体系中加入PMS,混匀,37℃保温30min,之后加入TCA终止反应。加异丙醇溶解显色,混匀,即可于548nm测OD值。规定:30min内548nm下OD值为1.0时的酶量为1个活力单位。比活力=活力单位数/毫克蛋白。

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