氨基酸总量测定:茚三酮比色法
1原理:氨基酸在一定pH范围内,能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。
2试剂:
(1)磷酸缓冲液(pH.8.04)制备方法如下:
称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml
称NAH2PO4·12H2O 11.9380g分别溶解定容500ml
取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液
(2)2%茚三酮溶液:
称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡(SnCl2·H2O)搅拌过滤(作防腐剂)→
于冷暗处过夜→定容50ml
① 氨基酸标液
称干燥氨基酸(如异亮氨酸)0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于另外100ml容量瓶
定容100ml,即得200Ug/ml标液
3操作方法:
(1)绘制标准曲线:
取7个25ml容量瓶,吸取标液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7个25ml容量瓶,加水补充
至容积为4ml,然后加茚三酮和缓冲液各1ml,于水浴加热15分钟,冷却后定容25ml,静置
15分钟,在570nm下测消光值,绘制标准曲线。
(2)样品测定:
取样品5.00~10.0g(液体样5-10ml)→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5g→加热过滤→用
30—40ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟,
冷却定容,静置15分钟于570nm下测定消光值,按下式计算氨基酸含量。
氨基酸含量(毫克/100克)=C/(W×1000)×100
C——从标准曲线上查得得氨基酸的量(Ug)
W——测定得样品溶液相当于样品的量(g)
注意事项:
茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色,使用前要进行纯
化,方法如下:、
取10g茚三酮容于40ml热水中,加一克活性炭,摇匀静置30分钟,过滤,将滤液放入冰箱中
过滤,即出现兰色结晶,过滤,用2ml冷水洗涤结晶,置干燥皿中干燥,装瓶备用。