酸水解—全自动氨基酸分析仪测定蜂蜜中17种氨基酸
蜂蜜是蜜蜂采集花蜜酿制的，而花是植物的生殖器官，植物的精华大部分聚集于此，蜜蜂采集植物的“精华”，含有多种分解酶的唾液与其融合酿造而成的，是大自然奉献给人类的天然保健食品，味道甜蜜且营养丰富。蜂蜜主要成分除葡萄糖和果糖外，还富含人体必需的多种氨基酸营养成分[1]。不同产地、不同花种蜂蜜主要成分基本相同，但是其中的氨基酸含量不尽相同。
目前氨基酸的分析方法[2]主要有化学方法、荧光光谱法、电化学方法和分光光度法等。其中荧光光谱法具有较高的灵敏度和较低的检出限，特别是全自动氨基酸分析仪[3-7]（荧光检测器）分析法具有较高的灵敏度和较强的操作和分析自动化能力。本文运用酸水解-全自动氨基酸分析仪法技术，建立了快速、简便而准确测定油菜蜜、洋槐蜜、紫云英蜜、枣花蜜等安徽省常见4种蜂蜜中17种氨基酸检测的方法，并解析天然蜂蜜中氨基酸的含量。现将该测定方法总结如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
仪器：日立L-8900氨基酸自动分析仪（配有荧光检测器），干燥箱，真空泵，水解管：耐压螺盖玻璃管（体积为20～30 mL）。
试剂：盐酸（优级纯），重蒸苯酚，柠檬酸钠的缓冲溶液，茚三酮溶液（二甲基亚砜150 mL+pH值5.2乙酸锂溶液50 mL+水合茚三酮4 g+还原茚三酮0.12 g）。混合氨基酸标准溶液2.5 mmoL/mL，SIGMA。
1.2 仪器分析条件
检测器类型：荧光检测器（VIS）；检测波长：570、440 nm；色谱柱：离子交换柱，柱温60 ℃；进样体积：20 μL；流动相；柠檬酸缓冲液，流速0.4 mL/min；柱后反应柱的柱温：135 ℃。
1.3 试验方法
准确称取2.0～2.5 g（精确到0.000 1 g）蜂蜜样品于水解管内，加入6 moL/L盐酸10 mL，再加入新蒸馏的苯酚3～4滴，漩涡振荡3 min后冷冻5 min，抽真空后充入高纯氮气，在充氮状态下拧紧耐压螺盖。将水解管置于110 ℃干燥箱内水解22 h后，取出。冷却后小心打开水解管，将水解液全部转移至50 mL容量瓶中，用去离子水定容，过滤。取1 mL滤液于5 mL容量瓶中，真空干燥，反复2次，最后蒸干，然后加入0.02 moL/L柠檬酸钠缓冲液1 mL，高速离心后经0.22 μm滤膜过滤后上机。
2 结果与分析
2.1 色谱分析
蜂蜜经酸水解后，运用氨基酸自动分析仪测定，脯氨酸在波长440 nm测定，其余16种氨基酸在570 nm波长下测定，17种氨基酸在该分离条件下达到很好的分离效果，17种氨基酸标样色谱见图1。
2.2 线性关系和检出限
为考察该方法的线性关系，准确配制了17种氨基酸浓度分别为1、2、5、10、25、50、100 μmoL/L的混合标准溶液，按前述的条件依次进行分析，以f（x）值为峰面积，x值为检测浓度（μmoL/L），得到标准曲线。17种氨基酸的线性方程及相关系数见表1。
该测定方法具有较宽的线性范围，17种氨基酸的线性范围为1～100 μmoL/L，线性回归系数均达到0.999以上；17种氨基酸的方法检出限范围在0.18～0.55 μmoL/L。说明了用该方法检测蜂蜜中的17种氨基酸是可行的。
2.3 方法的回收率
为了验证该测定方法的准确性和可靠性，对测定方法进行加标回收试验。选定油菜蜂蜜样品，在其中加入不同量的17种氨基酸混合标液，按照1.2中的试验方法进行处理和测定，根据标准曲线的回归方程计算回收率，试验结果见表2。
从以上结果可以看出，该方法的回收率为88%～106%，相对标准偏差RSD小于6%，试验结果表明，说明了用该方法检测蜂蜜中的氨基酸所得到的数据是准确可靠的。
2.4 样品测定
2.4.1 样品来源的真实性。寻求安徽天新蜂产品有限公司、安徽天保蜂园食品有限公司、安徽安粮蜂业有限责任公司、安徽王中王蜂产品有限公司、合肥众业蜂产品有限公司等蜂产品企业大力支持，企业在收购原料时，提供各地各种旺盛蜜源的初始样本。依据GH/T18796-2012标准各种蜂蜜感官要求，对样品进行感官检验、花粉颗粒辨识等，验证花种蜜单一性；并依据GB/T18932.1和GB/T18932.2进行碳-4植物糖和高果糖葡萄浆等掺假物质的检测，确保样品来源的真实性。
2.4.2 样品测定。采集了油菜蜜、洋槐蜜、紫云英蜜、枣花蜜等4种安徽省主要蜜源，各20个样本，运用此方法进行氨基酸测定，同时运用GB5009.5凯氏定氮法[4]测定蛋白质含量，各平均值见表3。由表3可以看出，蜂蜜中含有丰富的氨基酸，氨基酸的含量基本在0.1%～0.3%，且种类齐全，具有丰富的营养价值；4种蜂蜜含有氨基酸的总量略有差异，但含有的氨基酸种类基本相同，且各氨基酸所占比例基本相近；4种蜂蜜皆富含天门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸等多种氨基酸，不含胱氨酸；蜂蜜中蛋白质与氨基酸含量呈一定相关性，蛋白质比氨基酸含量高，基本是氨基酸含量的1.4～1.8倍。
3 结论
建立酸水解-全自动氨基酸分析仪测定蜂蜜中17种氨基酸方法，试验结果表明，该方法具有样品操作简便、快捷、准确度高、灵敏度高、高通量等特点。运用该方法测定了油菜蜜、洋槐蜜、紫云英蜜、枣花蜜等安徽省常见4种蜂蜜中的17种氨基酸，试验表明这4种蜂蜜均含有天门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸等多种氨基酸，但是不含胱氨酸，氨基酸总量基本在0.1%～0.3%，且种类齐全，具有很好的营养价值。
