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酵母转化实验_原生质体转化

2019.4.08

实验材料	酵母
试剂、试剂盒	YPD 山梨醇 CaCl 2-ME PEG 选择性再生琼脂
仪器、耗材	水浴锅离心机分光光度计培养箱
实验步骤	1. 在实验前2天，将转化用酵母菌株的单菌落接种到5 ml YPD培养基中，于30℃培养过夜（如果酵母菌株是温度敏感的应在低温下培养）。 2. 转化前一天晚上，从5 ml 过夜培养液中取适量的菌液，接种于盛有50 ml YPD培养基的250 ml 无菌烧瓶中，再过夜培养，使细胞密度达到1~2×10⁷细胞/ml（OD₆₀₀=0.5~1.0，依据菌株的不同有一定的差别）。 3. 室温下，1 100 g 离心5 min 沉淀细胞，细胞用10 ml 1mol/l 山梨醇溶液重悬，重复离心一次，细胞沉淀用5 ml 1 mol/l 山梨醇重悬。取适量的悬液用无菌超纯水作10^-6稀释后取其中的0.1 ml 涂YPD平板，于30℃培养2天。 4. 将细胞悬液转移到50 ml 的烧瓶中，分别加入5 μl 2-巯基乙醇和150 μl Glusulase。于30℃缓缓地摇动温育约30~60 min，取适量无菌超纯水作10^-3稀释后，从中取0.1 ml 涂布在YPD平板上，于30℃培养2天， 5. 将原生质体移到一个50 ml 圆底离心管中，室温下400 g 离心4 min。 6. 轻轻倒去上清，不要搅动细胞沉淀。加2 ml 1 mol/l 山梨醇，轻轻摇动液体重悬沉淀（沉淀细胞应该很容易离开管壁）。 7. 加入8 ml 1 mol/l 山梨醇溶液，以400 g 离心沉淀细胞，步骤6和7重复1次。 8. 重复步骤6，加入7 ml 1 mol/l 山梨醇和1 ml CaCl₂溶液，轻轻混匀，400 g 离心4 min，细胞以1 ml 山梨醇/CaCl₂溶液重悬。 9. 往150~200 μl 细胞悬液中加入待转化的DNA（最多可达10 μg）和10 μl 担体DNA，室温下温育10 min。 10. 加10体积的PEG/CaCl₂溶液，混匀，室温下静置10 min。 11. 以400 g 离心4 min 沉淀细胞。轻轻倒出含PEG的上清，细胞用0.5 ml 山梨醇/CaCl₂溶液轻轻重悬，将悬液移至10 ml 已融化并保温于55℃水浴的再生琼脂中，在旋涡混合器上短促混匀，然后迅速倒在适当的CM省却成分培养基平板表面，转动平板进一步混合细胞和琼脂。 12. 于30℃（或其他适当的温度下）培养直到菌落出现，菌落会出现在再生琼脂的表面或琼脂中，挑单菌落，在同样的选择平板上划线。如果转化的目的是为了破坏基因组序列，那么应从几个转化体制备DNA，以便通过DNA杂交分析相关染色体的区域。展开
注意事项	1. 千万不要用漩涡混合器振荡或剧烈摇动原生质体。如果这些细胞沉淀不易重悬，应尽管缩短离心的时间和转速。 2. 加入DNA的体积不应超过细胞悬液体积的1/10，每一次转化应该转化一个只加担体DNA的对照，即可指示回复突变的频率。