人晶状体上皮细胞培育的增殖及永生化
实验概要
人晶状体上皮细胞原代的和永生化细胞培养是为了一个能够调查研究人类晶状体上皮生理及白内障的模型系统而建立的。
人晶状体上皮细胞培养是靠分离来自进行早产儿视网膜病变治疗的婴儿晶状体上皮碎片，并且允许上皮细胞从外植体生长。通过使细胞培养感染腺病毒(Adl2-SV40)来达到细胞永生化。
实验步骤
1. 原代培养
人类晶状体是在24小时内获得的，来自5至12个月大的接受早产儿视网膜病变治疗的病人。在晶状体囊的后部切一小部分，用眼科镊夹持，切下的晶状体囊和相连的上皮放入一个60mm组织培养皿。这个上皮被切成2-3部分，每部分分装在单独的培养皿中，加入3mLDMEM培养基(含有20%胎牛血清以及50µg/ml庆大霉素)。在37°C， 5%CO2的培养箱中培养，每周换2次培养基介质。定期使用尼康血滴比色法相差显微镜检查，并且用35mm Nikon N2020 照相机拍摄。
2. 病毒感染
在原代培养完成融合后，细胞使用含EDTA的胰蛋白酶消化后继续培养。60%融合后，进入第三阶段的培养，细胞按1：10用Adl2-SV40 病毒感染并培养24小时。这时，去掉培养基介质，添加10ml新的培养基介质。细胞生长1周并以5~10 ×104每100mm的密度继代培养。细胞进行常规计数。
细胞病变效应分析用来记录培养基中的晶状体上皮细胞的感染程度。0.1ml的晶状体上皮细胞培养介质在培养3天后去掉，在六壁组织培养皿中的Vero细胞要在此条件下暴露24小时，并且滤掉残渣。在21天时，如果Vero细胞死亡，这个培养就被叫做制造者。早期的晶状体上皮细胞传代(上升到10)产生能够释放病毒进入培养介质的细胞系。这个介质对Vero细胞具有毒杀性。经过长期的传代，这些晶状体上皮细胞变成了病毒的非产生者。用1:1000稀释度的Adl2-SV40病毒进行控制测试表明病毒在同一条件下杀死了Vero细胞。
3. 超低温冷冻法
每一代细胞用酶从培养皿上除去，悬浮在冷冻介质(DMEM含20%胎牛血清和10%DMSO，或者含5%的胎牛血清)，分装(每个冷冻小瓶1~2×106个细胞)，以每分钟下降1℃的速度进行冷冻，并保存在液氮中。
4. 永生细胞的增殖
为了判定被感染细胞的增殖能力，50,000个细胞被装在60mm的盘子里(每个时间点3次复制)，用库尔特计数器进行细胞数量计数。生长鉴定需在生长了10天以上的时候进行，这时培养是融合的。
5. 数量倍增水平
用以下方程式，计算这个水平
Nf/N0 = 2×(1)
x=数量倍增值，Nf = 细胞最终数量，N0 = 最初接种于培养皿的细胞数量。
x = log (Nf/N0)/log 2。每次传代后，x 就被加到之前的数量倍增值以获得新的值。
6. 免疫组织化学
细胞被放入24孔板中，生长到60%融合时，用1m70%乙醇固定。加入200µl 的0.05 M Triscl，PH为7.4(洗涤缓冲)，细胞用一级抗体(单克隆鼠IgG为SV40抗原)以1:20稀释度培养1小时，用洗涤缓冲三遍后，细胞用二级抗体(免疫学抗体)室温培养15分钟，细胞像刚才一样洗涤缓冲，之后用抗生物素蛋白过氧化物酶培养1.5分钟，洗三次，用新鲜基质(二氨基联苯胺)处理15分钟。经过大量的冲洗，细胞在洗涤缓冲中含水，相位差显微镜下观察。
7. SDS-PAGE和免疫印迹
细胞在4°C是溶解，10,000离心，上清液用最初的抗体进行处理。细胞用琼脂糖偶联G蛋白进行免疫沉淀，免疫复合物通过离心方法收集，用裂解缓冲液进行冲洗，并停留在200 µl SDS-PAGE 含有50mM Tris-cl缓冲液中，PH为6.8，2% SDS，1% 二巯基乙醇，10%的甘油以及0.1%的溴酚蓝。根据Laemml，用10%的丙烯酰胺凝胶进行电泳。在硝酸纤维素膜进行免疫印迹后，用同一个抗体和125I-labeled protein A对印迹进行探查，并且暴露在Kodak XAR film下1至7天。对β晶状体的多克隆抗体从含有纯化幼龄晶状体βH-晶状体免疫兔子上获得。对人类γ-晶状体抗体是通过来自幼儿的晶状体单体蛋白组分免疫兔子获得。幼兽的γ-晶状体抗体是通过用幼兽γ-晶状体免疫兔子获得。
8. 同工酶表型以及染色体核型分析
同工酶和染色体分析是由来自密歇根州底特律的儿童医院Joseph Kaplan博士进行研究的。物种鉴定以及表型频率的计算是用乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)、葡糖磷酸变位酶1(PGM1)、酯酶D(ESD)、苹果酸酶、线粒体(Me-2)、腺苷酸激酶(AK-1)以及乙二醛- 1((GLO-1)进行。染色体计数是用100个中期分裂决定，以及9 Giemsa带核型决定。
