ACS Sensors封面|沙门氏菌快速检测的微流控比色生物传感器
英文原题：Microfluidic Colorimetric Biosensors Based on MnO₂ Nanozymes and Convergence−Divergence Spiral Micromixers for Rapid and Sensitive Detection of Salmonella
通讯作者：林建涵，中国农业大学教授
作者：Li Xue (薛丽), Nana Jin (靳娜娜), Ruya Guo (郭儒雅), Siyuan Wang (汪思源), Wuzhen Qi (戚武振), Yuanjie Liu (刘元杰), Yanbin Li (李延斌), Jianhan Lin (林建涵)
中国农业大学林建涵团队报道了基于二氧化锰纳米酶和微流控芯片技术的沙门氏菌快速检测的比色生物传感器，并搭配智能手机 App 进行数据处理，可以在 45 分钟内检测低至 44 CFU/mL 的沙门氏菌，且操作简单，不需要昂贵仪器，为食源性细菌的现场快速检测提供了一个有前景的平台。相关研究成果作为封面文章发表在 ACS Sensors 期刊上。
食品安全是最受关注的国计民生问题之一，近年来由食源性致病菌引起的食品中毒事件屡见不鲜。根据世界卫生组织（WHO）报道，沙门氏菌是全球引起腹泻疾病的主要原因之一，也是出现抗药性的血清型微生物之一。沙门氏菌的快速筛查是预防和控制沙门氏菌病、保障食品安全的关键之一。现有的食源性致病菌检测方法主要有培养法、聚合酶链式反应（PCR）以及酶联免疫吸附测定（ELISA），分别存在检测时间长、核酸提取操作复杂、检测灵敏度低等问题，难以满足食源性致病菌现场检测的实际要求。因此，急需开发灵敏度高、操作简单、集成度高的快速检测方法用于致病菌的现场快速检测。微流控芯片具有体积小、微混合器效率高、功能高度集成、易实现自动化等优势，是实现现场快速检测的理想平台。
近日，中国农业大学林建涵团队研制了一种集成的微流控比色生物传感器（lab on a chip）。其微流控芯片只有 4 cm×6 cm 大小，集成了混合反应、分离、检测等功能于一体。结合开发的智能手机 App 用于结果图像的处理，并将检测结果通过无线实时传输至云平台，用于风险评估与预警。
如图 1 所示，该比色生物传感器以二氧化锰纳米花（MnO₂ NFs）作为标记物放大生物信号，以扩缩螺旋微混合器、分离腔、检测腔等集成微流控芯片实现自动操作，以带有饱和度计算算法的智能手机 App 对图像进行处理。首先，将免疫磁性纳米颗粒（MNPs）、样品和免疫 MnO₂ NFs 在螺旋微混合器中充分混合和孵育，形成 MNP-细菌-MnO₂ 夹心复合物，在微流控芯片的分离室磁捕获。然后注入 H₂O₂-TMB 底物，夹心复合物上的 MnO₂ NFs 纳米花模拟酶催化，生成黄色催化产物。最后，将催化产物转入检测室，用智能手机 App 对其图像进行测量和处理，确定细菌的数量。该生物传感器可在 45 分钟内检测 4.4 × 10^1 -4.4 × 10^6 CFU/mL 的沙门氏菌，检出限为 44 CFU/mL。
图 1. 微流控比色生物传感器原理图
微流控芯片中扩缩螺旋微混合器的混合效率对该生物传感器的灵敏度有很大影响。首先用有限元分析软件 COMSOL 对微混合器进行了仿真，结果表明，扩缩结构螺旋微混合器混合效果明显优于无扩缩结构的螺旋微混合器（图 2A-B）。通过实验，也验证了该微混合器的实际混合效果较好（图 2C-E）。
图 2. 扩缩螺旋微混合器的混合效果仿真及实验结果
本研究将二氧化锰纳米花（MnO₂ NFs）作为纳米模拟酶来标记目标细菌，用于提高生物传感器的敏感性。首先对合成的该纳米材料进行了表征，其均一性和分散性都较好（图 3A-C）。然后对其模拟酶效果进行测试，结果显示，其催化效果明显，且其不同浓度的催化产物的图像吸光度和浓度具有较好的线性关系（图 3D-F）。将该模拟酶与生物酶（HRP）进行对比，其储存稳定性和温度耐受性都明显优于 HRP（图 3G-H）。
图 3. 二氧化锰纳米花表征及其过氧化物模拟酶概念验证
在最优参数下，建立了该生物传感器测定的饱和度值与目标细菌浓度之间的校正模型。用该生物传感器检测不同浓度的沙门氏菌，每个浓度做 3 组平行试验。结果显示，在浓度为 4.4 × 10^1 -4.4 × 10^6 CFU/mL 范围内，饱和度值（S）与细菌浓度的对数（lgC）呈良好的线性关系，且最低检测限为 44 CFU/mL。该检测限比传统的 ELISA 方法要低 2-3 个数量级，且该传感器灵敏性、特异性良好（图 4）。
与近期报道的一些细菌检测方法相比，该微流控比色生物传感器具有更高的灵敏度、更短的时间和/或更好的便携性。本研究的创新点主要包括：（1）利用模拟酶活性较高、稳定性较好的 MnO₂ NFs 作为信号探针，对生物信号进行有效放大；（2）研制了具有扩缩螺旋微混合器的微流控芯片，在芯片上实现了充分的免疫反应、有效的磁分离和高效的酶催化，从而大大提高了一致性；（3）开发内置饱和度计算算法的智能手机 App，精确测量颜色变化。
图 4. 微流控比色生物传感器传感器用于沙门氏菌的检测
