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结合MALDI-2技术的肝癌组织空间多组学分析策略

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IMSC Poster#布鲁克创新方案

蛋白成像、多肽成像、N-糖成像及病理染色相结合的多维度成像解决方案

前言

纤维胶原蛋白的三螺旋区(THR,triple helical region)展示了从脯氨酸到羟化脯氨酸的翻译后修饰,这对于细胞的信号转导、募集、增殖及迁移状态有重要的影响。MALDI质谱成像是一种免标记、在组织原位检测的生物样品成像技术,它可以在同一张组织切片上同时获取几百种至上千种分子的空间分布特征。它引入了分子空间分布的信息,有效地拓展了传统质谱技术的分析维度,使科学家从空间维度来审视生物分子的特征。

本实验针对肝癌组织样本,以MALDI成像作为核心分析技术,通过多种衍生技术相结合的方式,从同一块肝癌组织中获取了多个分子维度的空间成像信息。如图1所示,Pathology Staining可提供组织的病理学信息,N-glycan Imaging可提供N-糖分子的空间分布信息,MALDI HiPLEX-IHC可提供完整胶原蛋白的空间分布信息,Collagenase digest Imaging可提供胶原蛋白酶解产物的空间分布信息。将上述的信息整合分析,有利于科学家从多个分子维度、全方位地理解肿瘤微环境及癌症发生发展背后的分子调控机制。

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1. timsTOF fleX MALDI-2 的多维度空间分析策略

 

实验方法


以人的肝癌FFPE组织为样本,经过脱蜡、抗原修复等前处理后,用于空间多组学分析。多分子维度的成像分析包括N-糖分子、完整靶标蛋白及胶原蛋白酶解产生的多肽。其中,MALDI HiPLEX-IHC流程和胶原蛋白酶解步骤需经过适当的样本前处理和实验优化。

3实验结果与讨论

2展示了应用MALDI成像的方法对肝脏肿瘤组织中聚糖的空间成像研究。通过SCiLS Lab软件查看聚糖分子的平均质谱图。基于MALDI的原位分子成像技术给出了高信噪比的N-糖质谱信号,从而可对每个感兴趣的聚糖分子实现精确的峰提取。将MALDI成像结果与右侧的病理染色结果相结合,m/z 1581和m/z 1809两个N-糖分子在肿瘤区域T1和T2具有明显的低表达,而m/z 1976和m/z 2684则在肿瘤区域T1和T2呈现明显的高表达。将肿瘤区域与健康区域作对比,四种N-糖分子在两个区域呈现出差异性的空间分布特征,因此可作为潜在生物标志物进行进一步的验证研究。

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2.(左)肝癌组织中N-糖分子的MALDI质谱图及MALDI成像结果。(右)肝癌组织的H&E染色和FAP染色结果。

MALDI HiPLEX-IHC,即多重免疫蛋白成像工作流程,它将MALDI质谱成像技术与经典的免疫组化技术相结合,在抗体上连接了肽质量标签,经过抗体跟抗原的特异性反应,肽质量标签就会“聚集”在目标抗原位置,再通过MALDI技术原位检测肽质量标签、进而给出目标蛋白的空间分布图像。图3展示了通过MALDI HiPLEX-IHC获取的Vimentin、Collagen α1和Cd11b三个完整蛋白分子的质谱检测信号及相应的成像热图。通过与图2的成像结果比对,Vimentin和Collagen α1两个蛋白分子在肿瘤区域T1呈现出一定程度的空间表达。

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3. MALDI HiPLEX-IHC针对完整大蛋白分子进行空间成像,展现出肝癌组织的空间异质性。红色表示Vimentin;蓝色表示Collagen α1;绿色表示Cd11b(髓细胞标志物)。右侧展示了三者所对应质量标签的质谱信号。

MALDI-2是一种激光诱导后电离技术,它在MALDI离子化基础上用激光照射分子进行二次离子化,以降低离子抑制效应,提高离子化效率。与传统MALDI电离相比,MALDI-2的灵敏度提高了2-3个数量级。图4给出了MALDI 与MALDI-2技术对胶原蛋白酶解肽段的电离效果对比。图4(A)为两种技术产生的成像热图对比。图4(B)为两种技术产生的质谱图:从m/z 600至m/z 1500,MALDI-2展现出非常明显的电离信号增强作用。通过上述对比可以看出,无论是普通的脯氨酸肽段、还是羟化脯氨酸肽段,MALDI-2均能给出信号更强的、更为清晰的离子分布热图,这利于实现同其他类型分子的空间关联性分析。

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4. (A) 胶原蛋白酶解肽段的MALDI-2 成像热图。(B) 胶原蛋白酶解肽段的MALDI-2 质谱图。

结论
布鲁克公司在MALDI质谱成像领域深耕多年,针对不同类型分子的检测特点,开发出了N-糖分子成像方案、酶切蛋白成像方案及适用于完整大蛋白成像的MALDI HiPLEX-IHC工作流程;多种成像方案相结合,形成了完整空间多组学分析策略。布鲁克还提供了创新的MALDI-2激光后电离技术,有效地提高了分子的检测效率。MALDI-2技术的引入,进一步拓展了空间多组学成像方案的分子覆盖范围,使该方案在临床病理研究中展现出巨大的应用潜力。长按并识别二维码

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