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国家自然基金技术经验系列资料琼脂糖凝胶电泳技术
技术应用
1、DNA的切胶回收
2、DNA的分离
3、佐证DNA是否重组
4、验证质粒切割情况及其他分子生物学研究
实验用品
琼脂糖；TAE电泳缓冲液；溴化乙锭(EB)溶液；水平式电泳装置电泳仪；台式高速离心机；恒温水浴锅；微量移液枪；微波炉或电炉；紫外透射仪等
实验步骤
一、制胶
1. 根椐制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉（总液体量不宜超过锥瓶的50%容量）。琼脂糖粉末与0.5×TAE buffer的比例（w：v）参考表1，常用琼脂糖浓度为0.7-1%
2. 在锥瓶的瓶口上盖上保鲜膜或牛皮纸，并在膜或纸上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复数次，直至琼脂糖完全溶解；
3. 使溶液冷却至50℃-60℃左右，如需要可在此时加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5 μg/ml）或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混匀；
4. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3~5 mm之间。制胶模如下图所示，小胶倒入25-30 mL左右琼脂糖溶液，大胶则60-70 mL左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚；
5. 在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。
二、上样
1. 取适量样品与6×上样缓冲液混匀（如：1 μl样品与5 μl 6×上样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中；
2. 上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40 μl 为上限，大孔200 μl 为上限，具体和制胶膜规格相关）；
3. 每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
三、电泳
1. 加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流在40 mA以上；
2. 当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时（约40 min），停止电泳；
3. 紫外下拍照并观察。
致成提醒您
1. 电泳缓冲液放置时间过久会沉淀，因此一次性不要配太多。可以取5×TAE缓冲液贮存液稀释为工作液，现配现用；
2. 用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一；
3. 琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清；
4. 凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天；
5. 观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割DNA；
6. EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃；
7. 当EB太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30分钟后再观察。
