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国家自然基金技术经验系列资料细胞、组织总RNA的提取
技术应用
1、获得高纯度、高质量的总RNA
2、可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR分析需要。
实验用品
DEPC原液、0.1％DEPC工作液、RNAiso、氯仿、异丙醇、无水乙醇、1000μl移液枪、100μl移液枪、20μl移液枪、10μl移液枪、1.5 ml EP管、PCR管、高速冷冻离心机、研钵、液氮、保温杯。
实验步骤
1、取材
取正常或超低温保存的动物、植物组织50-100g。
2、研磨
（1）将组织放入预冷的研钵中加入液氮研磨，注意研磨时要用力碾磨并且保证研钵中始终有液氮防止RNA降解，直到将组织彻底研磨成粉末为止；
（2）待研磨充分之后将研钵中倒满液氮，让液氮慢慢挥发使碎末慢慢聚于钵底，同时用枪头将碎末刮到钵底，用1-2mlRNAiso将粉末完全覆盖；
（3）用铝箔盖上研钵静置10-15分钟，待RNAiso覆盖的粉末成雪糕状时继续研磨，使其充分融化成液体时分装到1.5 ml EP管中室温静置5min。 （如果研磨过程中不充分将会极大的影响RNA的质量）；
（4）将细胞放入1.5 ml EP管中，加入1mlRNAiso，用枪不断吹打使其裂解充分，室温静置5min；
（5）12000 g 5min 4℃离心；
（6）小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。
3、多相分离
（1）向上述步骤 2 的匀浆裂解液中加入氯仿（0.2 ml氯仿／1mlRNAiso）盖紧离心管盖，用手剧烈振荡 15 秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置 5 分钟；
（2）12000 g 15min 4℃离心；
（3）从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）；
（4）向上清中加入等体积的异丙醇，上下轻微颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置 10 分钟；
（5）12000 g 10min 4℃。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
4、RNA清洗
（1）小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75％的乙醇 1ml（切勿触及沉淀，75％乙醇为灭菌后干净的0.1％DEPC工作液配制），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁；
（2）12,000 g 4℃离心 5 min；
（3）小心弃去乙醇（为了更好地控制 RNA 中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。
5、RNA溶解
（1）室温干燥沉淀2～5 分钟（不可以离心或加热干燥，否则 RNA 将会很难溶解）；
（2）加入适量的 RNase-free（灭菌后干净的0.1％DEPC工作液） 水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀；
（3）待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。
致成提醒您
在总RNA提取的过程中极易受到外界RNA酶的影响，最终导致RNA降解，所以每一个环节都要做到严格注意。
1、整个实验操作过程最好是在无菌操作台中进行；
2、实验前需将实验所需的移液枪和1.5 ml EP管、PCR管用0.1％DEPC工作液浸泡过夜之后高压灭菌、烘干备用，目的是为了除去RNA酶；
3、由于DEPC有剧毒所以在对实验耗材的浸泡过程中需要带上口罩、手套并且在通风橱中操作；
4、DEPC极易见光分解所以浸泡过程中需要在避光环境中进行实验；
5、研钵清洗干净后用铝箔纸包好180℃烘烤2-3个小时备用；
6、在正式实验前需用75％乙醇将操作台喷洒干净，移液枪、枪头盒、饭盒等用酒精棉擦拭干净；
7、在整个实验过程中，操作人员需要带上口罩并且勤换手套。
