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不可不知的代谢组学常见问题汇总解答（中）

2018.12.27

上期我们给大家呈现了一些代谢组学常见问题，那接下来我们继续get今天的新知识！

问题15：在找到的代谢物列表中为什么会有名称不同保留时间不同的现象？

答：代谢物的数据库查询并不表示该离子就是这个物质，只是提供代谢物注释。根据物质分子量分解谱等信息查询，只能提供代谢物鉴定的参考，而物质的鉴定需要根据化学标准品与核磁共振质谱来分析。此外，质谱检测的时候也会有离子化与衍生化，进行物质鉴定需要综合考虑各方面因素。

问题16：重名现象的两代谢物需要叠加吗？

答：不应该叠加。另外需要注意的是，重名的代谢物，需要根据保留时间、分子量、分解谱等方法来判断它们是不是同一个代谢物；如果不是，命名的时候必须予以区别，相应地在数据分析时候单独对待。

问题17：如何选择检索的数据库？

答：代谢组学数据库多种多样。对于部分初生代谢物的气相质谱分析，有参考性较好的数据库；而对于液相质谱分析，目前没有固定的数据库。不同的液相质谱检测条件差异很大，对应检测的物质，在保留时间，一级分子量，二级及多级分解谱差异也很多，难以统一标准进行比较。通过多种数据库查询，比较、推断和分析将有助于解析物质结构。

问题18：土壤、饲料等非常规物质代谢组的意义如何？如何去设计实验？

答：土壤中成分非常复杂，如含有营养物质、垃圾物质、动植物残留、微生物等成分。因此，对于土壤，不推荐进行代谢组学研究。不同的饲料，成分不一，也需要根据饲料的组成的复杂度来判断是否适合于代谢物分析。在适合代谢物研究的基础上，实验设计可以参考动植物代谢组研究。

问题19：非模式生物进行生物信息学分析有什么难点，该如何进行？

答：非模式生物往往生物信息数据量少，不太适合直接进行组学数据统计与分析，一般建议将非模式生物的数据通过同源比对的方式映射到模式生物上，然后再以模式生物的数据进行系统的生物信息学分析。

问题 20：功能未知的蛋白如何进行分析？

答：可以通过同源比对的方式获取其关系最近的有功能的蛋白作为参考进行后续分析。

问题21：代谢组和毒理学的关系？

答：毒理学是一门研究外源因素（化学、物理、生物因素）对生物系统的有害作用的应用学科，是一门研究化学物质对生物体的毒性反应、严重程度、发生频率和毒性作用机制的科学，可以对毒性作用进行定性和定量评价。

代谢组学以指标分析为基础、高通量检测为手段，通过研究生物体内代谢物的种类与数量及其变化规律来阐述机体在正常生命状态及环境变化后的代谢过程。代谢组研究内容之一是不同生长环境及加物理、化学或生物性刺激后生物体代谢产物的应答，代谢途径或代谢网络的解析。

动物的毒害与植物的毒害，植物的生物胁迫（病虫害）与非生物胁迫（旱、盐、冷、热、紫外、重金属等）都会对生物体产生刺激。因此毒理学可以作为代谢组学研究的手段，而代谢组学研究可以为毒理学研究基础的阐述提供参考，两者相辅相成，以研究生物体代谢机制。

问题22：同一个处理，不同的重复之间进行非靶向代谢测定。每一个重复是一个单独的叶片、是不同株的，物种是烟草、大田的样品，测出来的结果差异影响大不大？

答：不同植株同一处理，生物学重复。样本确保一致（生长情况，植株大小，采样步骤等均要一致），8个重复间的差异一般都是能接受的。

问题23：介绍一下代谢组用的什么仪器？不同公司之间的仪器的差异？检测灵敏度？精确度？

答： GC-MS平台：Aglient 7890B-5977A：四级杆质谱仪，QMS；（是最常见的质谱仪器，定量能力突出，在GC-MS中QMS占绝大多数，无串极能力，定性能力不足，分辨力较低（单位分辨），存在同位素和其他m/z近似的离子干扰。

LC-MS平台：AB 5600 Triple TOF

问题24：如果找到的差异代谢物没有标准品，该如何进行鉴定？

答：一般情况下，如果没有找到合适的标准品，结构相近的物质也可以替代。

问题25：什么是广泛靶标？比如TCA三羧酸循环的一类代谢物怎么测？

答：广泛靶向：广泛靶向代谢组学既有非靶向代谢组学的优点也有靶向代谢组学的优点。这种广泛靶向的是不需要标准品的，这项技术是在前期已经建立了公共数据库以外的更多的代谢物，它的数据库更加完善，可以检测到更多。并且这个技术使用的是三重四级杆，这个是使用在靶向代谢组学上的技术，所以说它具有靶向代谢组的优点。❶高灵敏度: 通过离子井进行富集可以检测到很多低丰度的次生代谢物,而非靶技术无法检测到低丰度物质；❷定性准确：相比非靶技术，广靶利用分子量的同时利用二级谱进行物质定性；❸数据库全：每个物种都可以自建数据库，建立属于该物种特有的代谢库。

问题26：数据库的类型有哪些？

答： GC-MS数据库：Nist、feihn；

LC-MS数据库：HMDB、Metlin、自建库（大连化物所-许国旺组）。

问题27：非靶向代谢组学实验需要加入内标吗？

答：一般加入L-2-氯,苯丙氨酸为内标；QC中另加入内标共13种，分别为Carnitine C2:0-d3，Carnitine C8:0-d3，Carnitine C10:0-d3，Carnitine C16:0-d3，LPC 19:0，FFA C16:0-d3，FFA C18:0-d3，CDCA-d4，CA-d4，Trp-d5，Phe-d5，SM12:0，Choline-d4，进行保留时间校准。

在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱柱所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。

内标法的关键是选择合适的内标物。内标物应是原样品中不存在的纯物质，该物质的性质应尽可能与欲测组分相近，不与被测样品起化学反应，同时要能完全溶于被测样品中。内标物的峰应尽可能接近欲测组分的峰，或位于几个欲测组分的峰中间

内标法的优点是：进样量的变化，色谱条件的微小变化对内标法定量结果的影响不大，特别是在样品前处理（如浓缩、萃取，衍生化等）前加入内标物，然后再进行前处理时，可部分补偿欲测组分在样品前处理时的损失。若要获得很高精度的结果时，可以加入数种内标物，以提高定量分析的精度。

问题28：代谢组中植物样本准备中细胞破壁的方法有哪些？

答：主要有：(1)机械法：处理量大，速度快；例如球磨法、高压匀浆法、X-压榨法和超声波法等；(2)酶解法：利用水解酶破坏细胞壁中的聚合物成分；例如溶菌酶可水解细菌、放线菌细胞壁上的肽聚糖，纤维素酶可水解植物细胞壁上的纤维素，蜗牛酶可水解真菌细胞壁上的几丁质和甘露聚糖等；(3)其他方法：包括细胞自溶法、渗透冲击法、反复冻融法、酸碱处理法和表面活性剂处理法等。

问题29：对于样品中存在易挥发性的物质，在保存是该如何注意才能保证实验时这些物质没有挥发掉？对于样品中存在易氧化的物质应当注意什么？

答：易挥发性的物质，收集过程中难免会有丢失，如果气体或者极易挥发可采用进样小瓶收集。含易氧化的物质的样品收集要快，尽量少暴露于空气中，避空保存，有条件可以抽真空。微生物代谢速度非常快，所以所有的步骤需要尽快完，且每个样本量一样多。

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