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不可不知的代谢组学常见问题汇总解答（下）

2018.12.27

代谢组学的问题系列我们将在今天结束哦，还没秒懂知识的同学可以再温习一下哦~

鹿明生物

问题30：不同的样品都需要多少量？

1、细胞：1*10⁷（以动物细胞两种形态为例）

①悬浮培养的细胞：

连同培养基转移到15 mL的离心管（进口）中低速离心，使细胞沉淀于离心管的底部（1*10⁷个细胞为宜）,倒掉培养基（尽量倒干净）后可以用PBS快速清洗一次，再次离心，倒掉PBS（尽量倒干净），将离心管的尖端插入液氮中，淬灭细胞-80℃冻存，干冰邮寄，每个样品最好准备两管。

②贴壁培养的细胞：
快速倒掉培养基倒入PBS（若用移液枪加，则靠着培养皿壁加入，以免将细胞冲起），清洗一次，倒掉PBS，用移液器吸尽残余的PBS，将培养皿底部（外壁）接触液氮10 s，淬灭细胞加入500微升预冷的甲醇-水（4：1，V/V）（需色谱纯的甲醇以及双蒸馏水），用细胞刮刀将细胞刮下，移液枪转移至1.5 mL的离心管中向培养皿中加入500微升预冷的甲醇-水（4：1，V/V）将剩余的细胞尽量全部转移至1.5 mL的离心管中-80℃冻存，干冰邮寄。

2、血清：200ul
用离心管收集血液，37℃（或室温）静置 30min或1h 进行凝固分层。，3000rpm 4℃或常温离心10min，待血细胞完全沉降都管底后，取上清转至干净的离心管中；12000rpm 4℃离心10min，取上清分装到1.5mL EP管中，每管 0.1-0.2mL；-80℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

3、血浆：200ul
用肝素钠抗凝管（肝素、肝素钠、肝素锂）采集全血，并尽快进行血浆分离；采血后尽快于3000 rpm（4℃），离心15 min，待血细胞完全沉降都管底后，吸取上层血清，用EP管分装，取上层，每管0.1-0.2mL分装至1.5mL EP管内中；-80℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

4、尿液：1mL

晨起中段尿（临床）或晨间1h尿（动物）直接分装到离心管（进口）中，每管1mL；添加质量体积为1/100（w/v）的NaN3；收集好的尿液10000-15000转/分钟，于4℃温度下离心10分钟后，吸取中层澄清的尿液，用进口的1.5 mL离心管分装保存，200微升/管，最好保存两管，以保证两次实验的量。-80℃冰箱冻存，足量干冰寄送。

5、唾液：0.5 mL
禁食禁烟禁酒1h以上

上午9:30-11:30取样，蒸馏水漱口，将唾液外吐于无菌痰杯内（保持冰浴），不要咳痰，收集5-10min，4℃，12000rpm，离心20min，取上清，再经0.22um滤膜过滤除菌，500ul分装，保存于-80℃。

6、粪便或肠道内容物：200mg-5g
收集到新鲜粪便或肠道内容物样本，从粪便的不同部位挑3个点，称5g/例放到离心管中；添加一滴（约10uL）质量体积比为1/100（w/v）的NaN3（1mg/ml），分装样本200mg/管；迅速放入液氮中冷冻处理至少15min；-80℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

7、常规动物组织（心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、肌肉等）：200mg最佳

如果组织上有血，先用用生理盐水漂洗掉；根据具体实验设计取特定的部位，200mg/管装入标记好的离心管中；迅速放入液氮中冷冻处理至少15min；-80℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

问题31：如何判断一个GC-MS项目结果的好坏？

答：主要从如下方面考察：（1）样本的代谢物的提取和检测是否得到足够多的峰；（2）组间分群是否好。

问题32：TIC图形应以平行的方式将各组放在一个图中进行峰的比较，还是单独进行展现？

答：代谢组学的文章中，基本上都是单图展示，看起来比较清楚，当组别较多时放在一起会很混乱，项目组别少的时候，可以放在一起展示。

问题33：ChromaTOF软件是用于色谱峰的解卷积吗？能否用来对其他类型仪器所得数据进行分析？进行解卷积确定代谢物峰的依据是什么？另外，解卷积是仅对多重峰进行处理吗？还是将原始数据导入软件后的流程化处理？如果有对单一色谱峰进行解卷积处理的话？如何保证准确性？

答：所谓解卷积指对软件能将重叠的质谱图分开为“单一组分”的干净质谱图，以便更准确地定性和定量。ChromaTOF软件的优点是可以将去噪、解卷积、定性以及峰对齐一起快速地流程化完成。对GC-MS的数据来说，是最方便的处理软件，其它的软件能完成其中的一两步，但是要全都完成是不行的。单一色谱峰无需进行解卷积。

问题34：峰与代谢物如何一一确定？以标准品还是搜库？若是搜库，通常一个色谱峰对应的化合物会有一个列表，给出可能性从大到小的排列，如何从中选择？若是选可能性最大的化合物，可能不准确；若是选其他化合物，如何保证准确性？

答：先搜库，以软件给出的默认的那个代谢物为最大可能性的代谢物；若有标品，需要进样比对才能确保准确性。

问题35：代谢物的鉴定结果50%的相似度一定不可靠吗？

答：根据我们的经验，50%的相似度的定性结果未必不正确，而70%的相似度结果未必就正确，因为GC-MS分析中，总会有很多共流出的峰或低响应强度的峰，这些峰的定性时软件给出的相似度就会偏低，但它的定性结果未必就不准确，这个相似度讲的只是一种可能性，为了让研究者得到更多可供选择的差异代谢物，以防我们筛选标准过严而漏掉一些研究者感兴趣的差异代谢物，我们一般会将50%以上的结果都列上，这样研究者可以根据自己的实际情况取舍。

问题36：丰度是以峰面积数据，单位什么？丰度较低的怎么确定是不是背景？？

答：丰度就是代谢物的质谱响应强度，没有单位的。在用软件对原始数据进行前处理时（包括去噪音、解卷积等）设置信号与噪音的比值为10作为搜库的阈值，所以不会是背景噪音。

问题37：如上图1所示，相应Type对应的参数(R2X, R2Y, Q2, R2, Q2)的值在哪个范围最好？OPLS-DA为什么会有两个Q2？另外cum表示什么？

答：PCA分析中R2X >0.4为好；PLS-DA 和 OPLS-DA分析中，R2X 这个参数不重要了，主要是R2Y 和Q2，这两个值>0.5 为好，越接近1越好。OPLS-DA中Q2(cum)，是指建模后模型的预测能力，以大于0.5为宜，越接近1越好，cum 表示累积的意思。另外一个Q2 是进行模型验证，以防止随机拟合或过拟合的一个评价参数。

问题38：如上图1所示,结果中的A,N, R2X, R2Y, Q2, R2, Q2分别代表什么意思，它们的值在什么范围比较好？？

答：❶A代表建模时主成分的个数；❷N代表分析的样本数；❸R2X代表多元统计分析建模时，在X轴方向模型的解释率（或可以理解为X轴方向保留原始数据信息百分比的平方）；❹R2Y代表在Y轴方向模型的解释率（或可以理解为X轴方向保留原始数据信息百分比的平方）；❺Q2代表模型的预测率；❻R2代表模型验证时，将原始分类的Y矩阵、n次不同排列的Y矩阵与R2Y、Q2Y进行线性回归，得到的回归直线与y轴的截距值分别为R2 和Q2；用来衡量模型是否过拟合。

问题39： PCA得分图中为什么A2蓝方框和A1红圈会在圈外，是不是圈外的就表示结果不好，有什么方法改进？

答：这个圈圈表示95%的置信区间，圈外的点表示该样本的代谢谱和其他的所有分析样本的代谢谱的差异性大，一般样本数较大时会有一些离群点出现，是正常的现象，而且这两个离群点就在95%置信区间的周围，并未离得太远，建议保留，不需要做任何处理。

问题40：GC/MS或者LC-MS中，圈外的点是什么原因造成的？能不能剔除掉？

答：圈外的点表示该样本的代谢谱与其他分组样本的代谢谱差别较大，出现的原因有很多（包括样本采集、储存、运输、前处理、分析等），可以剔除也可以不剔除，由于离群的并不远，为了保持数据的真实性，建议保留。

问题41：没有原始数据，组与组之间数据的平行性如何？如果平行性不好，如何确保检测结果的准确性？组与组之间内标峰的差异大吗？是根据内标峰面积还是峰高进行归一化处理？依据是什么？进行归一化处理用到的数据是解卷积之后的数据吗？

答：我们可以提供原始数据的，前三个问题应该都是想问如何保证组间差异是真实存在的而非人为因素引入的。关于组学的数据质量控制，主要看质控样本的聚类，质控样本是贯穿整个分析过程，只要质控样本聚类不错，那么数据的准确性就能保证。引起组内差异大的原因非常多，比如：个体差异、平行样本也有差异、前处理和分析过程中的引入的差异，由于有质控样本做数据质量控制，因此，前处理和分析过程中的引入的差异是可以排除的。关于归一化的问题：我们通常采用的是总峰面积归一化法，这也是一种非常常用的归一化方法。原始数据先进行去噪、解卷积、定性以及峰对齐后，才进行总峰面积归一化。

问题42：在筛选出的N个差异代谢物中，有的代谢物在KEGG网站里找不到ID。在能找到ID的N-M个代谢物中有X种代谢物是样本中不存在的物质，既然样本中没有这种物质，为什么会被检测出来？（以奶牛样本为例）

答：我们搜库是基于人和动物的代谢组学数据库（Feinh库）搜的，因此应该说这些代谢物在人和动物里内都会有的内源性小分子，很多代谢物在KEGG 中没有对应的ID号，属于正常，KEGG并没有把所有的小分子代谢物都囊括进去，至于N-M个代谢物中有X种代谢物是奶牛血液中不存在的物质，这个结论是不正确的。有许多小分子代谢物在植物和动物体内都是存在的，植物的初级代谢物一般和动物的内源性小分子是相通的，只有次级代谢产物不同而已。另外Feinh库中的代谢物就是人和动物的小分子GC-MS数据库，它定性的结果应该是人和动物中都存在的小分子。

好了，那么本期内容到此结束，鹿明生物提供的问答系列也在此告一段落，之后大家有更多的问题可以咨询我们的电话热线：021-54291615，也可以在下方留言区写下您的疑问，我们将以最专业的解答回复您。

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