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16S+宏基因组助力浙江海洋大学科学家登录环境科学领域顶刊
前言
2020年3月31日，浙江海洋大学环境科学与工程系冯丽娟老师课题组在Bioresource Technology杂志（IF=6.669）发表了题为“Response of denitrifying community, denitrification genes and antibiotic resistance genes to oxytetracycline stress in polycaprolactone supported solid-phase denitrification reactor”的研究论文，该研究通过微生物多样性16S测序和宏基因组测序探讨了土霉素（OTC）暴露对污水SPD系统的反硝化性能、反硝化菌群落、反硝化基因和ARGs的影响。
基本信息
文章标题：Response of denitrifying community, denitrification genes and antibiotic resistance genes to oxytetracycline stress in polycaprolactone supported solid-phase denitrification reactor
发表期刊：Bioresource Technology
影响因子：6.669
涉及的欧易生物服务产品：微生物多样性测序（16S）
研究背景
氮污染是一个全球性问题，具有许多负面影响，包括富营养化、栖息地退化和对人类健康的威胁。异养反硝化细菌是一类应用最广泛的反硝化细菌，可以利用有机物作为电子供体将硝酸盐和亚硝酸盐还原为气态氮或氮氧化物。然而，废水和受污染水中有机物的缺乏仍然是实现高效反硝化的共同挑战。
在固相反硝化(SPD)过程中，可生物降解聚合物可作为生物膜形成的碳源和物理载体。在过去的十年里，SPD技术的研究主要集中在反硝化性能和微生物群落方面。此外，抗生素可对微生物生长、污染物去除性能产生不利影响并产生抗生素抗性基因（ARGs）。到目前为止，已经有几项研究调查了抗生素暴露对脱氮性能和微生物群落结构的影响。然而，在抗生素存在的情况下，关于SPD性能、微生物群落和ARGs的信息仍然很少。因此，研究在抗生素存在下SPD反应器中反硝化群落和基因模式的变化是至关重要的。
研究内容
本研究选用可生物降解的PCL聚合物作为SPD系统的生物膜载体和固体碳源。利用16S Illumina MiSeq高通量测序技术研究了不同OTC胁迫下nir S和nir K型反硝化菌的变化，并利用宏基因组学分析确定了反硝化群落、反硝化基因和ARGs的模式。
研究路线
研究结果
1.不同OTC胁迫下PCL载体反硝化系统的脱氮性能
在SPD系统运行的第二天，R1-3反应器对NO3−-N的去除率分别为93.93%(R1)、61.91%(R2)、51.21%(R3)(图1A)。土霉素的投加抑制了R2和R3的反硝化作用，但所有反应器均迅速进入稳定阶段，对NO3−-N的去除效果较好，说明反硝化完全。运行1个月后，3个反应器均进入II期，R2和R3土霉素浓度分别增至0.25 mg L−1和5.00 mg L−1。R3对NO3−-N的平均去除率(97.83±2.07%)明显低于R1(99.98±0.07%)和R2(99.98±0.0.7%)。与I期的氮相比，R3反应器在II期的大部分时间内都不能完全去除氮。R3反应器对对NO3−-N的平均去除率为(97.83±2.07%)，显著低于R1(99.98±0.07%)和R2(99.98±0.07%)的平均去除率(P<0.05)。TN的去除效果与对NO3−-N极为相似(图1B)，说明在不同强度的OTC胁迫下，反硝化过程中对NO2−-N、 (<0.10mg L−1)和NH4+-N(<0.20mg L−11)的积累很少。
图1 | 不同OTC胁迫的PCL反应器中，NO3−-N (A)、TN(B)的去除效率和有机物(C)在两个阶段中的变化
2.有机质利用性能
三个反应器在不同的OTC胁迫水平下CODMn的变化如图1C所示。两个阶段各反应器流出CODMn浓度均高于流入CODMn浓度，说明生物膜载体PCL有足够的有机物释放。如表2所示，R3反应器的流出CODMn浓度最高，说明R3反应器释放的有机物最多。第Ⅱ阶段R3流出CODMn平均浓度高于第Ⅰ阶段流出CODMn浓度，但R2流出CODMn浓度无明显差异。
3.16S测序研究反硝化细菌nir K和nir S中反硝化微生物群落随OTC胁迫的变化
变形杆菌是6个样品中的优势菌门，R3.2样品中的变形杆菌数量(63.82%)高于R1.2样品(29.62%)和R2.2样品(40.69%)(表3)。
在属水平上，共鉴定出8株nir K型反硝化细菌，各样品中鉴定出丰度最高的nir K型反硝化细菌是根瘤菌，分别占总nir K型序列的33.78%(R1.1)、26.95%(R2.1)、36.84%(R3.1)、17.71%(R1.2)、32.39%(R2.2)和49.79%(R3.2)，且随OTC胁迫的增加呈增加趋势。丛毛单胞菌科和罗丹诺杆菌科在OTC胁迫最高的样品R3.2中两者的相对丰度最高。在属的水平上，鉴定出6个nir S型反硝化细菌(表3)。在不同OTC胁迫的生物膜样品中，罗思河小杆菌属的数量相对较多。
4.通过宏基因组研究微生物群落、反硝化功能基因和ARGs随OTC胁迫的变化
· 4.1 物种组成
大多数序列属于细菌(94.20-99.67%)，少数序列属于古生菌(0.14-0.37%)、真菌(0.16-5.33%)和病毒(0.07-0.22%)。变形菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和放线菌门是生物膜样品中排名前5位的门，与16S Illumina测序结果相似（图2A）。OTC胁迫显著降低了生物膜中变形杆菌的相对丰度。图2B展示了列出TOP30优势菌属，如食酸菌属(Acidovorax)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、Hygenophaga属、慢生根瘤菌属(Bradyroot Obium)、阿菲波菌属（Afipia）和Ardenticatena属。优势属表现出明显的变异。
图2 | 宏基因组分析不同样本的物种组成，门（A）和属(B)水平
· 4.2抗生素耐药基因的丰度和多样性
在6个生物膜样品中共鉴定出74个ARG类型和317个ARG亚型(图3A)。丰度分别为3.04%(R1.1)、3.34%(R1.2)、2.60%(R2.1)、2.68%(R2.2)、2.64%(R3.1)和2.78%(R3.2)。在OTC胁迫(0.05-5 mg L−1)下，SPD系统运行近3个月，ARG总丰度无明显增加。6个生物膜样品中均有相同的优势ARG类型，占总ARG的88%以上。在优势ARG类型中，R2-3反应器中四环素抗性基因的丰度(8.5-9.0%)明显高于R1反应器(7.2-7.7%)，表明OTC胁迫主要增加了四环素抗性基因。在亚型水平上，四环素抗性基因有35个亚型，以otrA、tetW、tetPB和tetT为主(图3C)。此外，在控制反应器R1中，第Ⅰ阶段和第Ⅱ阶段之间的ARG也有很大的变化。
· 4.3反硝化功能基因丰度及多样性
KEGG通路分析表明，在SPD系统中，参与氮代谢的编码基因有52种，丰度分别为0.66%(R1.1)、0.56%(R1.2)、0.68%(R2.1)、0.58%(R2.2)、0.55%(R3.1)和0.56%(R3.2)。与氮代谢相关的基因丰度随着Ⅰ期反应器R3中土霉素水平达到1.0 mg L−1而降低。在Ⅱ期中，对照反应器R1中这些基因丰度也有所下降，这可能与OTC胁迫下R3反应器中与氮代谢相关的基因丰度降低有关。而在Ⅱ期，OTC压力分别为0，0.25和5mg L−1的3个反应器之间这些基因的丰度没有显著差异。
图3 | 宏基因组分析，得到TOP50的ARGs热图(A)、不同类型ARGs的丰度(B)和四环素耐药基因分布(C)
多种反硝化基因促进了SPD系统的高效反硝化。如图4A所示，丰度表现为NAR>NIR>NOR>NOS。在不同的OTC胁迫下，R2-3反应器中编码NAR的基因丰度均显著低于对照R1，尤其是nar H、nar R和nar J。在I期，土霉素浓度与5个反硝化基因呈负相关。在Ⅱ期，土霉素浓度与三种反硝化基因呈负相关。结果表明，在不同的OTC胁迫条件下，II期的相关性不再持续，主要与I期的适应有关。
· 4.4反硝化群落与反硝化菌对土霉素的抗性
在6个生物膜样品中有大量宿主含有反硝化基因，包括315个类型的反硝化属 (图4B)。在已鉴定的反硝化属中，有131个类型具有1个以上的反硝化相关基因，占所有检测到的反硝化属类型的41.6%。慢生根瘤菌属是唯一含有最多类型(14个)的反硝化基因的属，此外，在属水平上，nar H基因的宿主类型最多，其次是nir B、nos Z、nir K、nar g和nar J基因，均有50多种类型。
在100多个编码nir K和nir S的反硝化细菌中，只有8种同时携带nir K和nir S基因。在对照反应器R1方面，无OTC胁迫的SPD系统从Ⅰ期到Ⅱ期的反硝化菌丰度显著下降，这主要与可生物降解PCL中有机物释放速率下降有关。在0.05mg L−1的OTC胁迫下，R3反应器中的反硝化菌数量与对照反应器相比没有明显减少，但当OTC浓度增加到0.25 mg L−1以上时，Ⅰ、Ⅱ期的反硝化菌丰度均受到明显抑制，但在5.0 mg L−1的OTC胁迫下，R3反应器中也富集了大量的反硝化菌，表明R3反应器对土霉素的抗性能力较强。
图4 | 反硝化过程中功能基因的丰度：KEGG注释数据库(A)、优势反硝化菌分布(B)、编码otrA的反硝化菌(C)和编码otrB的反硝化菌(D)
含有otrA(图4C)的反硝化属有103个类型，共有25个属编码otrB(图4D)，其中16个是反硝化菌。编码otrB的优势反硝化菌为慢生根瘤菌属和Ardenticatena属。不同水平的OTC对不同反硝化菌的丰度有不同程度的影响。
研究结论
当土霉素浓度为0.05、0.25和1.0 mg L−1时，固相反硝化系统具有完全的反硝化性能，当土霉素浓度为5 mg L−1时，硝酸盐去除率仍可达90%以上。然而，在编码多种四环素耐药基因和多药耐药基因的SPD系统中，多种反硝化菌具有抵抗土霉素的潜力，这有利于高效的反硝化作用。SPD过程和OTC胁迫均可引起ARGs的迁移和转移，这主要与ARGs宿主的变异有关。
参考文献
Feng LJ, Yang JY, Yu H et al. Response of denitrifying community, denitrification genes and antibiotic resistance genes to oxytetracycline stress in polycaprolactone supported solid-phase denitrification reactor. Bioresour. Technol., 2020, 308: 123274.
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