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客户文章 | 蛋白质组学助力肠道屏障功能障碍保护作用机制研究

2021.3.22

文章标题：Proteomic Study on the Protective Effect of Kaempferol Pretreatment against Deoxynivalenol-Induced Intestinal Barrier Dysfunction in a Caco-2 Cell Model

发表期刊：Food & Function

发表时间：2020年8月19日

影响因子：4.171（中科院分区一区,Top期刊）

合作客户：江南大学

百趣生物提供服务：Label free非标记定量蛋白质组学

1.研究背景

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是食物链中常见的真菌毒素之一，广泛分布于谷物及受污染的食品和饲料中。有较多证据表明其对肠道稳态的毒性有影响，特别是由紧密连接(TJ)、黏附连接(AJ)、缝隙连接和细胞桥粒维持的肠道屏障完整性。山奈酚（KAM）是一种广泛存在于水果和蔬菜中的天然多酚抗氧化剂，在预实验中发现KAM是防止DON暴露时Caco-2细胞单层屏障功能失调的最有效试剂。于是采用蛋白质组学方法研究了 KAM预处理对Caco-2细胞模型中由DON诱导的屏障功能障碍的保护作用，从而为降低DON毒性效应的策略的发展提供理论基础。

2.材料和方法

主要技术：Label free非标记定量蛋白质组学
样本类型/分组：

Caco-2细胞：对照组，KAM组，DON组，KAM预处理组（KAM+DON组）

检测平台：Nano-LC-MS/MS
搜库/定量软件：MaxQuant
数据分析：R、STRING、SPSS

3.技术路线

4.研究结果

1. KAM预处理可改善DON暴露引起的屏障功能障碍

为了寻找预防或干预DON诱导的细胞屏障功能障碍的最佳候选化合物，作者选择了橙皮素、槲皮素、山奈酚、白藜芦醇、小檗碱、儿茶素、柚皮素和丁酸钠等植物化学物质，比较它们对抗DON诱导的屏障功能障碍的效果。结果发现在DON暴露时，KAM是唯一一个经TEER评估对保护细胞屏障功能有显著作用的物质。与对照组相比，DON处理分别导致TEER和FD-4的通量显著降低和增加，而经KAM预处理组(KAM + DON)处理后则有明显改善，表明KAM预处理有效地改善了DON对Caco-2细胞单层屏障功能的损伤，KAM对DON诱导的细胞屏障功能障碍起到保护作用。应用Label free定量蛋白组来全面了解KAM260和DON对细胞屏障功能影响的潜在机制。

图1 KAM和DON对Caco-2细胞模型的影响(A) TEER和(B) FD-4通量

2. 蛋白组学研究

与对照组相比，KAM组、DON组、KAM预处理组分别鉴定出670个、1295个和1052个差异表达蛋白（DEPs）（图2），表明KAM和DON处理均显著影响了Caco-2细胞中蛋白的表达。经KAM预处理后，差异表达的下调和上调蛋白均显著低于DON组，说明DON影响的蛋白的表达在KAM预处理后被最小化或补偿，这表明KAM对Caco-2细胞有潜在的有益作用，尽管DON仍然在KAM预处理组中起主导作用。

图2 各对比组火山图和DEPs统计

GO分析显示三组DEPs均显著(p<0.05)富集于细胞黏附分子结合(MF)、细胞连接(CC)和细胞连接组装(BP)，表明KAM和DON均显著影响细胞屏障功能（图3）。KEGG分析显示紧密连接、黏附连接和ECM相关通路在不同处理组中均富集，这证实了DON和KAM对细胞连接的影响。特别值得注意的是DON显著影响了黏附连接的代谢通路，表明黏附连接(包括细胞-细胞粘附和细胞-基质粘附)也是细胞连接的完整性所必需的（图4）。进一步分析KEGG富集的两条代谢通路(紧密连接和黏附连接通路)，KAM预处理通过PKA和MAPK/ERK通路影响紧密连接和黏附连接蛋白的表达和组装，从而改善对Caco-2细胞单层的屏障功能（图5）。

图3 GO富集分析

图4 KEGG分析

图5 紧密连接(A)和黏附连接(B)代谢通路及相关蛋白表达(以KAM + DON Vs DON为例)。

3.WB验证

为了验证蛋白质组学数据的准确性，作者对参与紧密连接和黏附连接通路的相关蛋白进行了western blot分析。结果表明，KAM预处理显著提高了受DON不利影响的CLDN4，CDH16和 MAPK1蛋白质的表达，与定量蛋白质组学的结果一致。此外，P-VASP分析显示，CON显著降低P-VASP表达，而KAM预处理组则显著增加其表达水平，表明 KAM预处理通过PKA提高VASP磷酸化水平起到保护作用。