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在反相多肽Flash纯化过程中，样品会损失吗？
对于市场现有的反相HPLC色谱柱而言，不管是粒径大小，孔径大小还是键和分子类型，科学家们都可以有多种多样的选择，来解决样品纯化时所遇到的疑难杂症，而在多肽合成以及纯化的过程中，由于多肽样品往往比较稀少且珍贵，其回收率（损失程度）一直时大家关注的一个方向，那么，当我们使用反相Flash对多肽样品进行柱层析的时候，它的损失程度会是怎样的呢？
今天我们将以及不同纯度的多肽样品进行纯化比较，来观察样品回收率情况。除此之外，我们还将检测pH对样品回收率的影响。
在每一次对多肽样品纯化之前，经常第一个需要我们考虑的情况就是，在现有的方法下，样品会损失多少，这个问题其实非常普遍，尤其是在上样量非常少的情况，会更加突出。此次，我们决定使用Biotage推出的最新型SNAP Bio C18色谱柱来观察不同样品在不同流动相下的回收率情况。SNAP Bio C18色谱柱使用全球性全封端硅胶基质，粒径可达20um，提供300Å的大孔隙，使其成为多肽Flash纯化的首选。
在Biotage® Initiator+ Alstra™微波多肽合成仪的帮助下，我们合成了ACP的小肽，其纯度为36%，Figure 1。
Figure 1: 粗产物ACP小肽HPLC分析谱图
粗产物分析后，我们对样品进行Flash纯化，将50mg样品溶于DMSO中，使用Biotage Isolera™ Dalton 2000系统纯化样品，使用色谱柱为：10 gSNAP Bio 色谱柱。
Figure 2. 梯度：10%-50%持续10柱体积（CV），乙腈-水体系，样品大约在30%的时候馏出。
Figure2: ACP粗产物溶于DSMO后的Flash纯化谱图报告
在将所有馏分收集后，我们对样品进行了纯度检测，最终发现产物ACP仍有48.1mg，回收率可达96%以上，值得一提的是，我们合并了处于峰尾的馏分4和5 ，旋干蒸发后，含有17.3mg样品，其中ACP的纯度仍然高达92%。
接下来，我们选择了粗产物GLP-1进行测试，其含有37个氨基酸，粗品纯度为26%，Figure 3。我们知道，通过改变pH值可以优化纯化条件，提高纯化效果，此次我们希望通过改变pH值观察其对回收率的影响。
Figure3: 粗产物GLP-1HPLC分析谱图，粗纯度为 26% 。
首先将150mg粗产物GLP-1溶于1mLDMSO中，使用Biotage® Isolera™ Dalton 2000系统纯化样品，使用色谱柱为：25 gSNAP Bio 色谱柱。（注：此处色谱柱的尺寸变大并不是由于样品量增加而是因为DSMO使用量增多而导致）
梯度：20%-70%持续10柱体积（CV），乙腈-水体系，根据HPLC谱图来推测，样品应该会在40%左右的时候馏出，然后这是在流动相加入了酸而得到的结果，在Flash条件（加碱性条件）下，我们仍然希望其在此梯度条件下洗脱出来。
Figure4: GLP-1粗产物溶于DSMO后的Flash纯化谱图报告，收集馏分23-31 (黑色箭头) 用于分析。
目标产物比预想中更早的馏出，然后在酸性条件下，产物附近出现了明显的杂质信号峰（without data），保留时间的变化使得产品纯度得到了很好的提升。.
在Dalton 2000的帮助下，我们收集了23-31部分的馏分，旋干蒸发后得到33.7mg样品，最终纯度为87%，对应的回收率为85%。
尽量这样的纯度不足以支持后续的生物活性测试，然后粗产物已经被富集，最终的HPLC制备可以通过会更低的进样量和更快速的方法得到目标纯度产品。
总的来说，在进行多肽的纯化制备或者富集的时候，通过SNAP Bio色谱柱和Isolera 系统，可以保证更高的回收率以及几乎可以媲美制备HPLC的纯度。另一方面，尽管加入了缓冲盐或者酸碱添加剂，SNAP Bio仍然可以保持较高的回收率。
那么您是如何在多肽纯化过程中减少样品损失呢？欢迎您留言和我们沟通。
