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画龙点睛，Nat Commun: SUMO化修饰组学揭示PIAS1新底物蛋白及调控细胞迁移机制

精准医学与蛋白组学

2020.2.24

本文由景杰学术团队报道解读

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SUMO化修饰是一种普遍存在、动态可逆的蛋白翻译后修饰类型，虽然修饰过程与泛素化过程很相似，又称为“小泛素化”，但是SUMO化修饰具有与泛素化修饰截然不同的功能。泛素化修饰的靶分子主要被蛋白酶体降解，而SUMO化修饰介导靶分子定位与功能调节。SUMO化循环过程与泛素化循环过程相似，包括活化、结合、连接、修饰和解离等过程，其修饰过程涉及SUMO活化酶(E1，包括Aos1和Uba2)、SUMO结合酶(E2，包括Ubc9)和SUMO连接酶(E3，包括PIAS、RanBP2和PC2)。

PIAS1(protein inhibitor of activated STAT1)蛋白是一种可以抑制信号转导与转录激活子1(STAT1)的特异性抑制蛋白，同时具有SUMO连接酶E3的活性，参与多种转录因子的活性调控和多种蛋白质的SUMO化修饰。PIAS1在肿瘤细胞的生长进程中具有关键作用，并可因不同类型的肿瘤而发挥促进或抑制肿瘤进展的作用，是癌症治疗的一个重要潜在靶点，并可作为抗炎因子调节炎症细胞粘附和抑制炎症损伤。在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤等肿瘤中，PIAS1可以通过促进DNA修复，促进肿瘤细胞的增殖和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡等作用，正向调控肿瘤的发生发展。而在依赖MAPK信号途径激活而实现细胞快速增殖的肿瘤，如胃癌、结肠癌等中，PIAS1可通过抑制MAPK信号途径从而抑制肿瘤的进一步发生发展。然而，PIAS1的作用机制仍有许多问题等待解答。

2020年2月11日，国际专业学术期刊Nature Communications发表了最新研究，来自加拿大蒙特利尔大学的 Pierre Thibault团队，通过SUMO化修饰组学，系统性的识别揭示PIAS1的潜在底物。研究人员共在544个蛋白质上鉴定到983个SUMO化修饰位点，其中62个蛋白质被认为是假定的PIAS1底物。其中，vimentin（VIM），是涉及细胞骨架组织和细胞运动的III型中间丝蛋白，在Lys-439和Lys-445残留物中由PIAS1进行SUMO化。作者认为VIM的SUMO化是其动态分解所必需的，而表达了去SUMO化的VIM突变细胞的迁移水平明显降低。这种方法不仅能够识别E3 SUMO连接酶底物，还可以针对PIAS1和VIM蛋白的SUMO化修饰在细胞活力中发挥的作用产生独特的生物学见解。

1、SUMO化修饰定量蛋白质组学研究

作者通过在Hela细胞中过表达PIAS1和敲除PIAS1的细胞系对比，发现了PIAS1在调节HeLa细胞生长和细胞迁移方面的重要作用。为了进一步深入研究，作者以特定位点的方式去识别PIAS1底物，将SUMO免疫亲和标签策略与代谢标记（同位素标记，SILAC）相结合，研究过表达PIAS1时蛋白质SUMO化的整体变化。组学研究发现，共定量到1756个蛋白质，同时定量到544个SUMO化蛋白上的12，080个肽段。其中62个蛋白相对应的91个SUMO化修饰位点被PIAS1过度表达，包括其已知的底物PML蛋白。

Figure 1. SUMO化定量蛋白质组学研究路线

2、PIAS1底物蛋白与功能分析

作者通过PANTHER和Gene Ontology (GO)功能分析，发现PIAS1调节多个蛋白质的SUMO化修饰，这些蛋白质在细胞中的作用是多种多样的。与整体SUMO化修饰一样，PIAS1介导的SUMO化可能在多个相互独立的生物过程中发挥作用。基于假定PIAS1底物的蛋白相互作用分析（STRING），证实PML核体、转录因子、细胞骨骼蛋白和RNA结合蛋白之间有着密切的相互作用，作者还发现多个假定的PIAS1底物与细胞骨骼组织相关，包括β-actin（ACTB）、α- tubulin（TUBA1B）和vimentin（VIM）。从组学数据来看，PIAS1在Lys-439和Lys-445中调节了III型IF VIM蛋白的SUMO化。

Figure 2. PIAS1底物蛋白互作分析

3、VIM的SUMO化调节其动态分解过程，有利于促进细胞迁移和活力

通过建立K439/445 R双突变体（Flag-VIMmt），研究人员证明PIAS1介导K439和K445的VIM的SUMO化；通过胶内酶解结合 LC-MS/MS技术，发现SUMO化和磷酸化之间可能存在串扰；同时利用伤口愈合测定法进行的生物学实验，综合表明VIM的SUMO化在细胞生长和迁移中发挥了作用，很大可能是通过调节VIF的功能或组成。

Figure 3. VIM的SUMO化是适当细胞迁移过程所需

作者将Flag-VIMwt和Flag-VIMmt转染到HeLa细胞中，并用RIPA裂解液裂化细胞。通过WB实验证实了前期推测，VIM 的 SUMO化确实大大增加了其溶解度。随后作者通过荧光显微镜量化了VIM 结构的比例，统计分析表明，与VIMwt相比， VIMmt促进了ULF（unit-length ﬁlament）的形成，波形蛋白中间丝（vimentin intermediate ﬁlament，VIF）形成也同时减少；进而作者结合蛋白、免疫荧光和FRAP测定的结构，描述了PIAS1介导VIM动力学控制的分子机制，揭示了PIAS1通过可逆的SUMO化修饰VIM进而刺激ULF的脱磷酸化，并促进ULF重新进入VIF成熟过程，从而调控细胞迁移和运动。

Figure 4. VIM的SUMO化调节其动态分解过程

值得注意的是，细胞骨骼蛋白在已识别的PIAS1底物中占有很大比例。不同于UBC9（E2-conjugating enzyme）底物通常在共有基序上进行SUMO化，在这些细胞骨架蛋白上发现的受体赖氨酸残基是高度保守的，但位于非共有序列基序中。这些观察结果表明，PIAS1可以作为一种适应蛋白，通过促进细胞骨骼蛋白的流动或动力学来改变细胞骨骼蛋白的更新或动态。

作者发现PIAS1在VIM蛋白的K439和K445残基上发生了SUMO化修饰，这种修饰提高了VIM的溶解度，并与磷依赖机制中ULF对VIF的吸收有关。VIM的SUMO化反过来有利于细胞增殖和活力，这可能导致癌细胞攻击性增加。当然，虽然这些发现可以揭示PIAS1介导的VIM SUMO化分子机制及其对癌细胞的侵袭性，但还需要更多的证据来进一步理解PIAS1介导的SUMO化在其他细胞骨骼蛋白上的功能以及这些细胞骨骼蛋白在细胞迁移过程中如何协同。

参考文献

Chongyang Li, et al., 2020, Quantitative SUMO proteomics identififies PIAS1 substrates involved in cell migration and motility. Nature Communications.

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