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Redox Biology | 乙酰化修饰组学揭示小檗碱抗炎作用新机制

精准医学与蛋白组学

2023.5.17

景杰生物 | 报道

小檗碱 (BBR) 是从中药黄连中分离得到的一种季铵生物碱。BBR具有降糖、调脂、抗菌、抗肿瘤等多重药理活性。其抗炎作用也已通过大量实验得到证实，在临床上被广泛用于治疗炎症相关性疾病，但其抗炎机制一直没有得到明确的阐释。

4月17日，南京中医药大学第一临床医学院尚文斌教授与方彭华副教授团队在知名期刊Redox Biology (IF=10.787，中科院生物学1区) 上发表了题为“Acetylation of p65Lys310 by p300 in macrophages mediates anti-inflammatory property of berberine”的最新研究成果。该研究通过乙酰化修饰组学探索了BBR抗炎的的分子机制，发现小檗碱通过抑制p300/ p65Lys310轴调节炎症因子表达。景杰生物为该研究提供了蛋白质组学与乙酰化修饰组学技术支持。

1 乙酰化修饰组学分析

作者首先通过细胞实验发现小檗碱通过抑制巨噬细胞分泌促炎因子发挥抗炎作用，有研究报道巨噬细胞中炎症因子的表达与蛋白质乙酰化水平密切相关，因此作者构建了LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞 (BMDM) 炎症模型，通过泛抗体检测了小檗碱处理对细胞整体乙酰化修饰的影响，结果显示BBR轻微上调了整体蛋白质乙酰化修饰水平。随后，研究者对不同处理 (Con、LPS、LPS+BBR) 的RAW264.7细胞进行了乙酰化修饰组学分析，共定量到1586个乙酰化修饰蛋白和3208个修饰位点。GO富集分析显示LPS组与LPS+BBR组的乙酰化修饰差异蛋白主要富集于代谢、免疫系统等生物过程(如图1E)。在免疫系统生物过程中，BBR处理后62个乙酰化修饰位点的修饰水平上调，29个位点修饰水平下调，作者关注到其中NF-κB蛋白复合物中RelA蛋白(p65)的K310与K122修饰水平发生了显著的改变（如图2A）。

图1 乙酰化修饰组学分析与功能注释

2 小檗碱抑制p65 K310的乙酰化修饰降低NF-κB活性

由于p65 K310的乙酰化修饰在炎症调控中发挥了重要作用，因此作者重点研究了p65 K310乙酰化修饰的动态变化和功能。组学分析显示LPS刺激后，细胞中p65 K310乙酰化修饰水平显著上调，而BBR处理后修饰水平又显著降低。WB实验和免疫荧光实验进一步验证了这一组学结果。K310位于p65的激活结构域，通过促进p65从细胞质向细胞核的易位在调节NF-κB活性中发挥关键作用。细胞实验表明BBR处理导致LPS刺激后的RAW264.7细胞核中ac-p65K310和p65水平降低，NF-κB的转录活性受到抑制。总之，BBR通过降低p65 K310的乙酰化修饰水平抑制p65从细胞质向细胞核的易位和NF-κB活性。

图2 BBR下调巨噬细胞中p65 K310的乙酰化修饰水平

3 p65 K310点突变对BBR抗炎活性的影响

为了进一步验证BBR是否通过抑制p65 K310乙酰化修饰水平发挥抗炎作用，作者通过点突变构建了p65 K310Q和p65 K310R细胞系。免疫荧光实验表明，BBR处理逆转了p65野生型细胞中LPS诱导的p65总荧光强度和p65核荧光强度的升高，而p65 K310突变后抑制了BBR处理引起的p65易位减弱（如图3E）。NF-κB的活性也呈现相似趋势，p65 K310Q和K310R消除了BBR处理导致的NF-κB活性降低。此外，在p65野生型细胞中，BBR处理显著降低了促炎因子 (IL-1β、MCP-1和TNF-α) 的表达，而在BBR处理的p65 K310Q和K310R细胞中，它们的水平没有发生显著改变。以上结果表明小檗碱通过降低p65 K310的乙酰化修饰来抑制NF-κB活性，从而发挥抗炎作用。这一结果也在急性炎症和慢性炎症肥胖小鼠模型中加以验证。

图3 p65 K310点突变对BBR抗炎活性的影响

4 BBR通过降低p300表达下调p65 K310乙酰化修饰水平

为了探索BBR下调p65 K310乙酰化修饰水平的机制，作者分析了BBR处理后蛋白质水平发生显著改变的HAT/HDACs，其中p300引起了作者的注意，此外PPI网络分析显示p300可以调节p65的乙酰化修饰，因此作者在细胞模型与动物模型检测了BBR对p300表达的影响，发现小檗碱可以抑制炎症发生过程中巨噬细胞p300水平的升高以减少p300与p65 K310的结合，降低p65 K310乙酰化修饰水平，最终抑制促炎因子的分泌。

图4 BBR通过降低巨噬细胞P300的表达下调p65 K310乙酰化修饰水平

综上所述，该研究通过乙酰化修饰组学揭示了小檗碱通过抑制p300/ p65Lys310轴发挥抗炎作用的新分子机制。BBR通过减低p300表达下调NF-κB亚单位p65 K130的乙酰化修饰水平，抑制NF-κB易位和转录活性，从而降低炎症因子的表达。该研究为小檗碱后续的临床炎症相关的疾病治疗和临床应用提供了重要的药理学依据，也为药物的机制研究提供了新思路。

图5 BBR抗炎机制图解

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参考文献

1. Shuchen Zhang, et al. 2023. Acetylation of p65Lys310 by p300 in macrophages mediates anti-inflammatory property of berberine. Redox Biology.

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