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生物药的研发(四) LC-MS/MS生物技术药物的生物分析

SCIEX

2020.4.03

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本期“婷视角”专栏，婷姐谈生物药的研发第4期：LC-MS/MS生物技术药物的生物分析

生物药的研发(四)声音内容

Hey，大家好，我是您的质谱应用专家刘婷，来自SCIEX中国市场部，负责高级解决方案的开发与支持。15年的一线应用经验，让我深感到质谱应用信息共享的重要性。无论是质谱前沿技术，还是常用技术的深入应用，都希望在我的这个专栏中能和大家分享。“婷视角，看分析“希望拓宽您的视野，进入美妙的的质谱应用世界。

大家好，我们又见面了。通过上期内容，我们了解了毛细管电泳和毛细管电泳质谱联用技术主要应用于生物技术药物质量控制的3个方面：纯度、等电点以及电荷异质性分析、糖基分析。接下来，我们主要聊一聊“LC-MS/MS在生物技术药物的生物分析”。

随着LC-MS/MS在蛋白/多肽，寡核苷酸，单抗和抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)三类热点药物定量方案上的成熟，LC-MS/MS已成为生物技术药物不可替代的检测工具。和传统的酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）方法比较，LC-MS/MS有更好的方法专属性，更宽的线性范围，方法开发更快速等优点。本期内容，我们就主要针对这3类药物做介绍。

首先来聊聊蛋白/多肽定量。蛋白/多肽类药物，分子量一般<10,000 Da，灵敏度要求高，所以通常需要比较专属性的前处理和质谱采集技术来消除杂蛋白干扰。

在前处理上，主要考虑蛋白沉淀法(Protein Precipitation, PPT)、固相萃取（Solid phase extraction, SPE）和免疫捕获三种方式，且三种方式各有优缺点。蛋白沉淀法，主要针对分子量<2000 Da的小肽，方法简单，但基质效应强；SPE方法是最常用前处理方式，可对样品做适当富集，且提取专属性大大优于蛋白沉淀，但SPE对操作熟练度有较高要求，且需要2-3个星期的方法开发时间；免疫捕获的专属性最好，但需要特定的蛋白受体才能将目标蛋白从血浆中捕获出来，蛋白受体获得有一定难度，技术要求高。

如何用简单的前处理方式，也能获得理想的定量效果？这3个技术，多反应监测三级扫描（MRM³）， SelexIon^®差分离子淌度技术和MicroLC技术，也许能帮到您。SelexIon^®差分离子淌度技术和MicroLC两个技术，我在去年的节目上做过详细介绍，由于本期节目时间限制，我就不多做介绍了，大家可以查看往期节目。

SCIEX 三重四极杆线性离子阱复合型(QTRAP^®) 质谱仪提供独特的MRM³工作流程。传统的多反应监测（MRM）流程主要是监控母离子到子离子的反应过程，而MRM³监控的是母离子-子离子-孙离子的反应过程，选择性更强，所以MRM³能显著的减少背景噪音干扰，减轻对前处理和液相分离的要求。以CYP450 3A5蛋白的特异性肽段（SLGPVGFMK）为例, 在MRM扫描模式下，靠近保留时间有明显的基质蛋白峰干扰；使用MRM³扫描模式后，能明显去除该干扰，并降低本底噪音，提高了5倍灵敏度（图1）^[^1]，线性范围近4个数量级（图2 ）, 重现性和准确度均能满足生物样品分析要求。

图1. MRM³扫描模式去除杂蛋白干扰，降低本地噪音，提高灵敏度.

图2. 上图为MRM³扫描模式提供近4个数量级的线性（柱上1.2fmol to 805fmol）；下图为LLOQ 1.2fmol色谱图（CV%=2.7%, Accuracy=116%）.

了解了蛋白和多肽药物定量，再来看看寡核苷酸。寡核苷酸是一类20个左右碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸)，通常分为反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA药物（siRNA）、含CpG基元的寡核苷酸（CpG- ODN）、核酸适配体和小核苷酸（MicroRNA，miRNA）等。

LC-MS/MS技术对寡核苷酸药物具有高灵敏度、高选择性、能够区分 5’端和 3’端的缩短代谢物的优势^[^2]。沉淀蛋白法、液液萃取（Liq-liq extraction，LLP）、和固相萃取（SPE）法，都可应用于寡核苷酸类药物的生物样品前处理。其中，SPE法因能富集更多的待测物而广泛被使用。飞诺美公司（ Phenomenex）的 Clarity OTX SPE就是专门针对寡核苷酸的生物基质样本而设计，能消除大量基质干扰，专属性高，其寡核苷酸的回收率均大于80%^[^3]。

成功的寡核苷酸类药物需要良好的体内代谢稳定性，在药物报批中，往往会特别关注寡核苷酸类药物的代谢物。这就需要先鉴定代谢物，然后依据报批规则，可能需要对主要代谢物定量，LC-MS/MS可以同时定量原药及其代谢物^[^4]。其中，代谢物的鉴定，往往使用高分辨质谱（High Resolution Mass Spectrometry, HRMS），同时由于HRMS越来越完善的定量能力，越来越多的科学家希望使用HRMS一台仪器来进行寡核苷酸类药物相关的定性、定量工作。图3中可以发现，由于寡核苷酸药物的强基质干扰，使用高分辨MRM（MRM^HR）扫描模式能专属提取0.05 Da窗口的子离子碎片而消除大量的干扰，与高分辨一级全扫描（TOF-MS）模式比较，灵敏度提高了10倍^[^5]。另外，在寡核苷酸的定量上，通常会使用离子对试剂，对质谱仪造成一定污染；MicroLC的使用不但能提高灵敏度，还能减少离子对试剂在质谱上的引入，减轻仪器污染，所以也越来越被关注。最后，特别提到的是：寡核苷酸药物需要使用质谱仪的负离子模式进行检测，需要质谱仪良好的负离子响应，这一点同蛋白药完全不同。

图3. 复杂基质中MRM^HR扫描模式的高选择性可以获得更好的最低定量限LLOQ. TOF MS的背景干扰导致其LOD仅为0.5 nM，而MRM^HR扫描模式可达0.05 nM的LLOQ.

最后，我们来了解一下单抗和ADC药物。单抗药物的分子量一般为150 KDa, 分子量较大，通常使用ELISA方法测定；但在临床前实验中，LC-MS/MS常常作为ELISA的互补验证方法而使用；LC-MS/MS经典的检测流程是：免疫捕获后，酶切，LC-MS/MS检测特异性肽段完成定量。但如果没有特异性抗原或是多个单抗共给药时，免疫捕获可能就无法发挥作用，美国施贵宝的Hao^[6]建立了一个广谱测定单抗的方法，使用4倍甲醇完全沉淀蛋白，取沉淀蛋白球进行酶切，而后使用SCIEX Triple Quad^TM5500系统定量，完全符合方法学要求。我们的专家客户，也使用该方法进行了尝试，在QTRAP^®5500系统上可实现0.2ug/mL的灵敏度，堪比免疫捕获的灵敏度，重现性和精确度都符合生物样品分析要求^[^7]，但该方法需要较高的前处理操作技巧。

ADC药物是一类由单克隆抗体和小分子细胞毒素通过化学偶联子连接起来的新型药物。由于ADC的复杂性，其药代动力学研究中需要监测多种分析物，主要包括：结合型抗体、总抗体、结合型小分子化合物、游离小分子化合物及其代谢物，有时还会对抗体药的抗体进行检测（anti-drug antibodies，ADA）^[^8]。结合型抗体、总抗体和ADA的测定，主要使用ELISA方法测定；结合型小分子化合物、游离小分子化合物及其代谢物，主要使用LC-MS/MS方法测定。

美国施贵宝的Hao^[^9]开发了一种使用磁珠捕获，基于SCIEX Triple Quad^TM系统，同时检测血清中ADA，残留单抗和人源IgG的LC-MS/MS方法，为ADA免疫原性评价提供了直接、快速的多化合物测定方法。勃林格殷格翰的Lin-Zhi^[^10]，使用MicroLC联合 SCIEX Triple Quad^TM6500系统同时测定ADA的不同亚型，可实现常规ADA亚型的高通量分析。

本期内容，我们介绍了LC-MS/MS在蛋白/多肽，寡核苷酸，单抗和ADC定量应用。

最后，总结一下本期内容：

蛋白药定量中的基质干扰难题，不妨尝试一下高选择性的MRM3扫描和SelexIon^®差分离子淌度技术；
LC-MS/MS是短链寡核苷酸（15-30 mer）的主流测定手段, 需要质谱良好的负离子灵敏度；
LC-MS/MS不但应用于单抗和ADC药物定量，还可应用于ADA免疫原性评价；
蛋白药的灵敏度难题，SCIEX M5 MicroLC和OptiFlow®离子源可以提高蛋白药5-20倍的灵敏度。

本期内容，就到这里结束了。下期内容我们主要介绍“LC-MS/MS应用到完整蛋白定量和生物技术药物的代谢物分析”，期待下期和您见面！

参考文献：

1.Kelli Jonakin. et al. High Selectivity Quantification of Protein Isoforms using MRM3 Workflow. SCIEX Technical Note.

2.Laixin Wang. et al. Oligonucleotide bioanalysis: sensitivity versus specificity[J]. Bioanalysis. 2011, 3(12) 1299-1303.

3.ClarityOTX. User’s Guide for Extracting Oligo Therapeutics from Biological Samples. 2019, 26th September 2019.

4.Matthew Ewles. et al. Quantification of oligonucleotides by LC–MS/MS: the challenges of quantifying a phosphorothioate oligonucleotide and multiple metabolites[J]. Bioanalysis. 2014, 6(4), 447–464.

5.Quantification of Large Oligonucleotides using High Resolution MS/MS on the TripleTOF® 5600 System. SCIEX Technical Note.

6.Hao Jiang. et al. Fully Validated LC-MS/MS Assay for the Simultaneous Quantitation of Coadministered Therapeutic Antibodies in Cynomolgus Monkey Serum[J]. Anal. Chem. 2013, 85, 9859−9867

7.Ting.Liu. et al. A Generic Approach for Absolute Quantitation of the Monoclonal Antibody in Human Serum Using Triple Quadrupole Mass Spectrometry. 2015 ASMS Poster.

8.郭建军. et al. 抗体偶联药物的药代动力学研究进展[J]. 药学学报. 2015, 50(1 0): 1203—1209.

9.Hao Jiang. et al. Innovative Use of LC-MS/MS for Simultaneous Quantitation of Neutralizing Antibody, Residual Drug, and Human Immunoglobulin G in Immunogenicity Assay Development[J]. Anal. Chem. 2014, 86, 2673−2680

10.Lin-ZhiChen. et al. Development of Immunocapture-LC/MS Assay for Simultaneous ADA Isotyping and Semiquantitation[J]. Journal of Immunology Research. 2016, 14.