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抗体药物LC-MS生物分析
本文来自于凡默谷药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica, 2020, 55(3): 453 −462，由中国科学院上海药物研究所的高宇雄, 钟大放教授所著，若有侵权，请告知立刻删除。
在抗体药物的生物分析中, 液相色谱-质谱联用(LC-MS) 技术已经成为传统配体结合分析(LBA) 的一种重要的替代或补充方法。对抗体药物LC-MS 法生物分析的进展进行综述并有实际案例供参考。
自20 世纪90 年代末以来, LC-MS 一直是灵敏、准确和快速分析小分子药物的有力工具。最近, 已经开发了各种LC-MS 技术来定量复杂生物基质中的蛋白质[15]。通过LC-MS 定量蛋白质, 可以在蛋白质的水解肽和完整的蛋白水平上进行。
对完整的蛋白直接进行质谱分析, 由于去除了酶解步骤, 可以使生物分析工作流程更快, 理论上还可以获得更完整的数据[16,17]。但是受限于仪器, 当前基于LC-MS 的抗体定量研究绝大多数都是在肽水平进行的, 肽水平的定量可以提供更高的灵敏度、准确性和重现性。
对抗体的肽水平进行定量, 指的是将目标蛋白酶解之后, 对获得的特征性肽段(signature peptide, SP)进行绝对定量(以稳定同位素标记类似物为内标)。这种以肽为中心的方法, 也被称为自下而上法。
与大分子量的蛋白质相比, 肽具有更好的LC-MS 兼容性[18]。主要的原因有:
① 肽段在质谱上的灵敏度远远高于蛋白质;
② 大多数MS 分析器的m/z 检测上限比较低(<1 500), 无法分析相对较大的蛋白质的多电荷母离子, 而大多数肽段的m/z 可以很容易地被几乎所有MS分析器检测到;
③ 在体内环境中, 蛋白质通常会携带翻译后的修饰, 这会改变蛋白质的质量并引入相当大的分析变异性, 而当在肽段水平上定量蛋白质时, 选定的肽段通常不会发生变化, 从而确保检测分析的可靠度和重现性。
在肽段水平的定量检测, 只需要在低分辨的三重四级杆质谱上即可实现。一般使用的是选择反应监测(SRM) 或称为多反应监测(MRM) 模式, 与小分子的质谱分析相似, 对肽段的母离子和碰撞产生的子离子进行两次选择。相较于LBA, LC-MS 具有更高的灵敏度、更好的定量准确度和更宽的定量动态范围, 并且可以通过切换离子监测的通道, 在一次LC-MS 分析中定量多个分析物[19]。
由于肽段的母离子一般带有多电荷, 在SRM模式下, 相同的m/z 可能指向的并不是同一个肽段, 由此受到了样品中基质的干扰。而肽段被打碎之后, 其产生的碎片所带电荷数变少, 子离子m/z 有可能大于母离子的m/z, 如果在定量分析时选择这样的离子对, 可以进一步的提高分析的选择性和灵敏度。
例如Duan 等[11]在开发抗体的LC-MS 法时对肽段的离子对进行优化, 优先选择子离子m/z 大于母离子的离子对
当MS 优越的选择性与充分的LC 分离相结合时,LC-MS 便为复杂基质中蛋白质的定量提供了一种通用和强大的工具。LC-MS 法定量蛋白的基本流程包括: 样品的纯化或富集、目标蛋白的酶解、最后对确定的特征性肽进行检测, 完成蛋白的定量。在这个过程当中, 与小分子的分析类似, 同样用稳定同位素标记的类似物用作内标(IS), 以提高分析的准确度[20]。
以肽为中心自下而上定量目标蛋白, 已经成为目前最广泛使用的LC-MS 分析策略。尽管如此, 该技术的发展仍然有其发展瓶颈。从最开始选择合适的肽段开始, 优化酶解条件, 确保酶解的效率和重现性, 最后优化液质参数, 这些步骤都相对复杂和耗时, 由此限制了分析通量。除此之外, 酶解过程可能丢失完整蛋白质的必要信息。
以抗体为代表的蛋白质药物, 生物转化表现出比小分子药物更多样化的代谢途径, 包括碳水化合物肝脏介导的清除、溶酶体代谢、抗体Fc 介导的清除(通过结晶化)、FcRn 结合与抗体的结合, 以及抗药抗体介导的消除等[21]。而在水解肽的水平进行量化时, 肽序列仅部分体现蛋白质的信息, 丢失关于碳水化合物转化和抗药抗体相互作用的信息等。
LC-MS 技术在抗体药物生物分析中的实例
血清/血浆中抗体的药动学(PK) 研究
LC-MS 法已被广泛应用于血浆/血清中mAb 的定量, 以支持临床前和临床PK研究。Hagman 等[54]开发了LC-MS 方法来定量食蟹猴血清和人血清中的模型抗体药物。通过前处理将25 μL 血清样品中约50%的血清总蛋白去除, 人和食蟹猴样品中模型抗体的定量下限均可以达到2 μg·mL-1。Ouyang 等[15]则将颗粒内酶解与LC-MS 相结合, 用于猴子血浆中mAb 候选药物的分析。
除此之外, 也有学者通过建立不同的LC-MS 法或LBA法来检测同样的抗体样品, 对不同的分析方法进行全面的比较。例如Lu 等[55]分别采用白蛋白耗竭、蛋白A捕获和抗体捕获3 种前处理方式, 对mAb 候选物CNTO736 进行LC-MS 定量。
他们所得到的结论是这3种方法都为PK研究提供了足够的灵敏度。FernándezOcaña 等[10]建立了LC-MS 方法定量人血清中的游离和总的抗MADCAM单抗, 游离mAb 由生物素化的抗独特型抗体捕获, 用链霉亲和素磁珠富集, 总mAb 则通过蛋白G磁珠富集。
本实验室最近建立了一种LBA 分析方法和两种与不同前处理相结合的LC-MS 方法[29], 首次对大鼠和食蟹猴血清中抗CD47 的mAb 候选药物(SHR-1603)进行定量。其中, LBA 法所使用的是MSD 电化学发光仪器, 通过形成“CD47-单抗药物-标记性二抗”复合物, 检测完整的单抗药物, 测定范围19.5 ng·mL-1～10 μg·mL-1。
LC-MS 法则使用了两种不同的前处理方式: 沉淀颗粒内酶解, 用有机溶剂提取目标抗体, 然后对其进行酶解, 测定范围250 ng·mL-1～500 μg·mL-1;磁珠亲和富集后酶解, 用抗原CD47 包被的磁珠对样品中的目标抗体进行免疫亲和富集, 并在磁珠上完成后续的酶解, 最后都用同样的质谱分析方法来检测特征性替代肽段, 测定范围为100 ng·mL-1～100 μg·mL-1。
3 种方法都成功应用于临床前PK研究, 最后获得了有显著差异的PK曲线。
该研究表明3 种方法获得的药物浓度在低剂量组中显示出很好的一致性(药物暴露率的比值在1.05～1.11), 而在中剂量和高剂量组中, 使用LC-MS 方法测得的药物浓度高于通过ECL方法获得的药物浓度, 这可能是由于所测的抗体形式不同(游离mAb 和总mAb)。LC-MS 方法对于SHR-1603的PK 评估显示出较高的准确性、分析效率和成本效益。
如前文所述, 免疫亲和富集与LC-MS 相结合的杂交分析方法, 可以提高抗体定量的灵敏度。这种方法也有助于测量生物基质中除抗体以外的靶标。比如通过将抗体药物本身作为捕获抗体, 用于定量猴和人血浆中存在治疗蛋白的抗药抗体。
此外, LBA也可以与LC-MS 平行使用, 例如, LBA和LC-MS 已经被应用于在抗体偶联药物(ADC) 的生物分析中, 测定ADC 药物的药物抗体比(DAR)[56]。ADC 药物通过mAb 的靶向作用, 特异地传递所携带的小分子药物。
DAR和药物负荷分布是决定ADC体内疗效和毒性的关键参数,DAR的微小变化会导致靶向部位暴露量的显著变化。Xu 等[57]建立了检测一种ADC 药物的亲和富集结合LC-MS 的分析方法, 成功测量了体外和体内的DAR。
尽管在过去的十几年中, LC-MS 法定量抗体的研究蓬勃发展, 但用此方法获得临床PK数据并提交新药研究申请和生物制品许可申请的例子非常少[58]。抗体药物的生物分析试验必须得到验证, 以满足监管的要求。蛋白药物的LC-MS 分析应该遵循监管指南的哪些部分, 这一点在2018 年FDA颁布的《工业用生物分析方法验证指南》中还未明确[59]。
美国药学科学家协会(AAPS) 生物分析组的蛋白质LC-MS 生物分析小组, 在2015 年首次提出在蛋白质LC-MS 生物分析方法验证过程中应该评估的方法参数和验收标准, 为蛋白质LC-MS 生物分析方法的验证提供一些基本原则[60]。该白皮书侧重的是使用酶解得到替代肽的LCMS方法, 旨在支持非临床毒代动力学和临床药代动力学研究。该白皮书认为, 由于大蛋白(如抗体) 分析的复杂性以及与LBA的结合, LC-MS 分析蛋白的接受标准相对于小分子LC-MS 应该适当放宽, 验证精密度和准确度应设为20% (LLOQ为25%)。
组织中抗体的分布
研究抗体在组织中的分布情况, 对于评估抗体药物的安全性和有效性有重要意义。尽管LC-MS 法已被广泛应用于血浆/血清中mAb 的定量, 组织中的mAb 定量工作却较少被报道。
与在血浆/血清中直接定量相比, 组织样品需要额外的前处理, 开发组织样品提取、清理和酶解的最佳方式。由于抗体的分布容积小, 组织内抗体浓度比体循环普遍低(除非组织抗原的富集), 组织中的残余血液会对定量产生较大干扰,而有效的清除往往又会导致组织内抗体的损失。
Duan 等[11]使用nano LC-MS、有效的样品制备和高通量肽段优化策略, 对小鼠7 个组织中的两个mAb (8c2和cT84.66) 进行定量, 其LOQ 为0.156～0.312 μg·g-1组织, 该方法用于评估长期多剂量给药后稳态下mAb的组织分布。
盒式给药
如前所述, LC-MS 能够同时定量多个靶蛋白, 因此能对候选药物进行盒式给药研究。对同一组动物注射多种药物的盒式剂量可以极大地减少动物的用量,提高临床前研究的效率和速度。
盒式给药已被普遍用于筛选小分子药物, 现在发现它更适合于候选mAb 的初步研究。这是因为多个mAb 的研究通常不会带来药物-药物相互作用的风险, 蛋白质的PK 不受CYP450和转运蛋白的影响; 且找到多个mAb 的最佳的共同配方是相当简单的。
Jiang 等[13]开发并验证了LC-MS 方法同时定量两个共给药的mAb, 该方法对两个靶标都有良好的灵敏度、重现性和准确性。该方法应用于猴体内的毒代动力学研究, LC-MS 获得的PK 图谱与通过对每个抗体进行单独的LBA分析获得的PK图谱高度吻合。
Li 等[61]在皮下注射盒式给药的研究中, 血浆中的LOQ为0.1～0.5 μg·mL-1, 该方法在一次研究中可获得4 个mAb 的PK参数。
