已陆续停产！失去鲎试剂，内毒素怎么测？

美谷分子仪器

2021.9.10

3 月 22 日，湛江安度斯发布公告称，由于受国家政策影响，决定停止供应部分鲎试剂，单支凝胶法鲎试剂（0.1mL）将于今年 6 月 30 日停产，四次装凝胶法鲎试剂（0.5mL）将于今年 12 月 31 日停产；文中还表示国内药品、医疗器械放行将面临困境，并建议药企、医疗器械企业尽早选择其他替代测试方法。

对于经常使用内毒素检测试剂的小伙伴来说，这无疑是一则重磅消息，毕竟在内毒素检测方面，鲎试剂几乎是唯一使用的试剂，更是中国药典规定使用的试剂。

湛江安度斯生物有限公司是 CRL 公司 1997 年在华收购的控股合资公司，而 CRL 公司是美国三大鲎试剂企业之一，安度斯公司研发和生产的内毒素检测产品在国内相关领域有着不小的知名度，也是国内第一个发布此公告的鲎试剂公司。不过，随后国内另一家知名鲎试剂公司厦门鲎试剂生物公司在 3 月 25 日发布了关于正常生产销售鲎试剂的声明，算是稍微缓解了一下小伙伴们的担忧。当然，发生了这么多事的起因是今年 2 月 5 日，国家林业和草原局、农业农村部发布公告将鲎科的中国鲎（Tachypleus tridentatus，亦称东方鲎、三棘鲎、中华鲎）和圆尾蝎鲎（Carcinoscorpius rotundicauda，亦称圆尾鲎），升级为国家二级保护动物，意味着内毒素检测试剂所用原料鲎将受到严格管控。

说了这么多，可能有些没有了解和接触过相关领域的小伙伴们会一头雾水，那么内毒素、鲎试剂以及人们是如何把它们两个看似不会产生关联的事物联系在一起的呢？先来讲讲什么是内毒素， 1892 年，科学家 Richard 在研究霍乱弧菌的时候，发现革兰阴性菌细胞壁外膜中有一种不溶性成分，它能够引起人体发热、休克、器官损害等病理表现，因其毒性效应和性质与外毒素有显著差异，就用内毒素这一术语来描述该物质。随后多年对革兰阴性菌细胞壁外膜的超微结构技术和生物分析技术，证实内毒素是磷脂双分子层结构。

内毒素是一种脂多糖，由 O 特异性抗原、核心多糖和类脂 A 三部分组成复合体。

它的一般特性有：

不是蛋白质，非常耐热，只有在 160 ℃ 的温度下加热 2 到 4 个小时，或强碱、强酸、强氧化剂加温煮沸 30 分钟才能破坏它的生物活性。

革兰氏阴性菌细胞崩解时才释放出来。

作用无特异性，内毒素致病症状和病理变化大致相同，如发热、白细胞增高、腹泻、血管舒缩机能紊乱，糖代谢紊乱，严重时甚至发生休克。

人们重视内毒素检测的原因是细菌在环境中普遍且大量存在，尽管内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但是注射方式进入血液则会产生危害，所以生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）都需检测内毒素含量后符合标准的才允许投入市场销售。

接下来再讲讲鲎这种奇特的生物，鲎，音 [hòu] ，属于蛛形纲（Arachnida）剑尾目（Xiphosura）的海生节肢动物，鲎从 4 亿多年前就出现在地球，至今仍保留其原始而古老的相貌，它与三叶虫一样古老，所以有 “ 活化石 ” 之称。

它的最典型特征是血液为蓝色，这是因为它血浆的主要成分是血蓝蛋白，含铜量很高，由于鲎肉含有对人体健康和生命安全产生极大危害的成分，故不宜食用。但是科学家从它们身上发现了更加重要的价值，即从它们独特的蓝色血液中提取出变形细胞溶解物制成试剂后，可准确、快速地定性或定量检测样品中的细菌内毒素，这种提取物一旦接触内毒素就会凝固。正是这样一个发现，使人们将鲎试剂作为最主要的一种内毒素检测试剂。目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂（LAL）和东方鲎试剂（TAL）两大类，检测原理和效果一样，其原理如下图：

鲎试剂通过一系列的酶促级联反应最终发生凝固，利用这一原理，内毒素检测分为定性或半定量的凝胶法和定量的光度测量法，而后者又进一步分为浊度法和显色法，这两种方法均以动力学检测为主，称为动态浊度法和动态显色法。

使用经过 Molecular Devices 公司验证的酶标仪并结合 SoftMax Pro GxP 合规软件进行数据采集和分析，可满足企业在 FDA 21 CFR Part11 等法规要求的合规环境中获取和存储数据，维护数据完整性。SoftMax Pro 软件内置针对内毒素检测试剂盒的检测模板，无需设置，直接读数后自动化获得数据并判断结果是否通过。

｜重组 C 因子法｜

传统的鲎试剂法除了不符合国家生态资源保护要求外，还存在 β-D- 葡聚糖引起的非特异性干扰，使 G 因子旁路活化导致假阳性，为了适应内毒素检测的新形势，重组 C 因子法或许会成为另一种可选的内毒素检测手段。

实际上，早在 2018 年 9 月美国食品药品管理局（FDA）首次批准使用重组 C 因子法进行细菌内毒素放行检测的药物，一款用于治疗成人偏头痛的单抗药物；同年 12 月欧洲药典起草了重组 C 因子法细菌内毒素检测的新章节；而在最新的 2020 版中国药典中也将重组 C 因子法列为了细菌内毒素检测方法。此方法先后被不同国家和地区在这样短的时间内重视起来并形成规定的检测方法，的确有着传统鲎试剂所不具备的优势，根据中国药典里的介绍，它是一种人工合成的 C 因子，被细菌内毒素活化后，可与荧光底物作用产生与内毒素浓度成比例的荧光信号，本法为终点荧光法，因其反应原理而不存在 G 因子旁路干扰，具有较高的专属性，因此适合于含有 β- 葡聚糖干扰的样品检测；

本法所用试剂不含有 B 因子和凝固酶原、凝固蛋白原等，因此，含有对上述物质抑制或增强作用的样品适合使用重组 C 因子法。鲎试剂与重组 C因子法反应原理的比较如下图所示：

在国内新政策颁布前， Molecular Devices 公司便已在自家酶标仪上率先使用 Lonza 公司的 PyroGene 重组因子 C 试剂盒进行内毒素检测的测试了，上面的比较示意图中重组 C 因子法亦是这一试剂的反应原理，在 Molecular Devices 公司 SpectraMax i3x 酶标仪上通过 SoftMax Pro 软件以 380 nm 激发波长和 440 nm 发射波长对从 0.001 EU/mL 到 5 EU/mL 梯度浓度的标准品进行荧光信号读取，利用自定义的 Workflow 功能可以实现 0 时间点读数 -37 °C 孵育 1 小时再读数的自动读取流程，通过 SoftMax Pro 软件计算孵育 1 小时后读数和 0 时间点读数之差，以差值作为纵坐标

标准品浓度作为横坐标绘制线性标准曲线（见下图），得到 R² 值为 0.996 以及比产品说明书建议的范围（0.005 EU/mL 到 5.0 EU/mL）更低的内毒素浓度。