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项目文章 | IF=11.556！多组学及新算法解析新冠肺炎儿童的分子变化

迈维代谢

2021.9.10

● 期刊：Theranostics

● IF：11.556

● 发表时间：2021.07

言

前言

目前新冠病毒仍在全球肆虐，而中国在政府的积极应对下，彻底的扫清了国内的病毒传播。但是要彻底阻断全球疫情，依然任重道远。作为科研公司，迈维积极为国内科研工作者提供专业完善的服务，为抗击疫情做出自己的贡献。

2021年7月，迈维代谢为广州市妇女儿童医疗中心和中科院武汉病毒所的关于新冠感染儿童的项目提供蛋白组和代谢组服务，相关文章发表在Theranostics期刊上。

由新型冠状病毒引发的2019年冠状病毒(新冠肺炎)大流行已成为百年一遇的公共卫生危机。研究发现，所有人都容易感染新型冠状病毒，在性别或年龄上没有显著差异。来自不同国家的报告显示，与新冠肺炎成人相比，绝大多数新冠肺炎儿童的症状较轻。大多数新冠肺炎儿童是轻微症状或无症状感染，而严重疾病如急性呼吸窘迫综合征和多系统炎症综合征在新冠肺炎儿童中较为罕见。

已经提出了几种理论来解释感染新冠肺炎的儿童和成人之间的临床症状差异。一个合理的理论是，与成人相比，儿童可能对新型冠状病毒有明显的反应，这主要归因于儿童和成人之间免疫系统的组成和功能反应性的差异。例如，儿童对新型病原体的T和B细胞反应，如记忆B细胞快速产生的天然抗体，在成人中未见。此外，幼儿通常在肺和气道粘膜同时感染其他病毒，这可能会将新型冠状病毒的感染限制在病毒对病毒的相互作用和竞争上。

到目前为止，新冠肺炎儿童的分子改变仍有待研究，这种努力将有助于更好地理解儿童和成人之间临床症状差异的机制。

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图1.实验设计和血液样本

CC：COVID-19-children；HC：Healthy children；AC：COVID-19-adults；HA：Healthy adults

NO.1

新冠肺炎儿童的分子改变特征

使用蛋白组和代谢组识别新冠肺炎儿童与健康儿童的分子改变，分别检测到121个差异表达蛋白(DEPs)和416个差异表达代谢产物(DEMs)(图2A-B)。发现更多的DEPs和DEMs在新冠肺炎儿童中下调，表明新型冠状病毒感染后儿童正常生物学过程的一般受到抑制(图2A-B)。然而上调的分子也表现出较强的表达变化，说明儿童中同样出现与新冠肺炎相关的分子改变。

为了进一步确定新冠肺炎儿童相对于新冠肺炎成人的分子改变，通过Normalized Abundance Values (NAVs)，消除了成人和儿童之间的内在差异。同样，保留了在> 80%的儿童和成人中同时定量的332种蛋白质和783种代谢产物，以确保数据质量。PCA分析表明，可以通过蛋白质组学或代谢组学数据明确区分新冠肺炎儿童和新冠肺炎成人。使用NAVs，确定了新冠肺炎儿童与新冠肺炎成人之间的196个DEPs和449个DEMs(图2C-D)。尽管在新冠肺炎儿童中上调和下调的DEPs数量相似，但在新冠肺炎儿童中下调的代谢产物数量要多得多，这表明新冠肺炎儿童中代谢过程的抑制作用强于新冠肺炎成人。

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图2.新冠肺炎儿童在蛋白质组学和代谢组学层面发生的变化

接下来，使用GO和KEGG通路对蛋白质和代谢产物进行分析(图2E-F)。发现新冠肺炎的儿童、成人或健康儿童的生物学过程和代谢途径存在重叠，如蛋白质组水平的血小板脱颗粒(GO:0002576)、凝血(GO:0007596)、纤溶(GO:0042730)和纤溶酶原激活(GO:0031639)(图2E)以及ABC转运蛋白(KEGG ID: map02010)、氨基酸生物合成(KEGG ID: map01230)，虽然这些过程/途径中的大多数也在新冠肺炎成年人的血液样本中富集，但在新冠肺炎儿童中的改变程度要强烈得多。

通过重叠的新冠肺炎儿童与健康儿童或新冠肺炎成人的DEPs和DEMs，分别在新冠肺炎儿童中识别出44个DEPs和249个DEMs发生了特异性改变(图2G-H)。分别对这些DEPs (图2I)和DEMs(图2J)进行了功能富集分析。同样，凝血相关过程在蛋白质组水平高度富集，而参与氨基酸生物合成的合成代谢相关途径在代谢水平富集，表明这些生理变化在儿童对新冠肺炎反应中的潜在作用。

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图2.新冠肺炎儿童在蛋白质组学和代谢组学层面发生的变化

NO.2

基于机器学习分析新冠肺炎儿童的分子特征

尽管鉴定出44个DEPs和249个DEMs (图2G-H)，但在新冠肺炎儿童中不同分子发生了不同程度的改变。确定最佳的生物分子组合不仅有助于对不同类型的患者进行准确分类，还可为揭示儿童新冠肺炎的潜在发病机制提供有用信息。在此，作者开发了一个名为iBM的算法，该算法由三个步骤组成，包括相互DEPs或DEMs选择(MDS)、候选组合生成(CCG)以随机选择10000个组合，以及最终组合优先化(FCP)以最大准确度和最小偏差获得蛋白质或代谢产物组合(图3A)。

通过计算曲线下总面积(AUC)值评估候选模型的准确性，作者还计算了Total Root Mean Aquared Error (RMSE)以测量预测偏差。在FCP步骤中，广泛使用的机器学习算法，Penalized Logistic Regression (PLR)被用于模型训练和参数优化(图3A)。分别测定了蛋白质组和代谢数据的组合。

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图3.机器学习分析新冠儿童分子特征

结果显示，有8098种蛋白质组合和8376种代谢产物组合的总AUC值为1，表明过多的组合可能会使现有数据达到完美的准确度。然而，预测得分和观测值之间的最小RMSE值将确保模型在新数据上的稳健性和可靠性。总RMSE值为1.83%和7.01E-07时，确定了两种最佳组合的优先级，包含5种蛋白质凝血因子XI和IX (F11和F9)、烯醇酶(ENO1)、纤维蛋白原α(FGA)和γ(FGG)，以及5种代谢产物甲基丙二酸(MMA)、二氢乳清酸(DHOA)、吲哚乙醛(IAAld)、色氨酸(TRP)和甘露醇(图3A)。这两种组合都可以很好地区分新冠肺炎儿童与健康儿童或新冠肺炎成人，AUC值为1(图3B-G)。此外，这些组合的混淆矩阵和RMSE分析结果也显示出对不同样本进行分类的高准确度(图3C、D、F、G和H-O)。

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图3.机器学习分析新冠儿童分子特征

此外，还计算了单个蛋白质或代谢产物的总AUC值和总RMSE值。对于5种蛋白，总AUC值范围为0.77至1，总RMSE值范围为6.57%至36.13%。对于5种代谢产物，所有的总AUC值均为1，而总RMSE值的范围为10.97%至28.72%。尽管单个分子可以在当前数据上达到完美的准确度，但多分子的组合对于减少预测偏差无疑是重要的。

NO.3

新冠肺炎儿童中的分子改变与轻度临床症状有关

除了对不同样本进行分类之外，新冠肺炎儿童中特异性改变的蛋白质和代谢产物以及其他分子也可以部分解释新冠肺炎儿童和新冠肺炎成人之间的临床症状差异。在蛋白组合中，F11、F9、FGA和FGG等4种蛋白参与凝血级联反应，在新冠肺炎儿童中的表达均高于健康儿童或新冠肺炎成人(图3L-M)。F11和F9通过一系列凝血因子的蛋白水解活化参与凝血过程中凝血酶生成的启动。FGA和FGG有助于形成纤维蛋白凝块，以响应凝血因子介导的凝血酶爆发性生成。

此外，在新冠肺炎儿童中高表达钙离子结合蛋白S100A9，其在炎症期间诱导炎性细胞因子分泌和免疫细胞迁移。这些结果表明，免疫反应/炎症过程在新冠肺炎儿童中显著表达。相反，发现血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂，如SERPINA5、SERPINC1和SERPINF2，会对凝血级联反应产生负调节作用，在新冠肺炎儿童中显著上调，而在健康儿童或新冠肺炎成人中则相反。

有趣的是，ENO1是分解代谢糖酵解途径最后步骤的关键酶，在新冠肺炎儿童中显著下调(图3L-M)。研究表明，缺氧诱导的代谢重编程从线粒体呼吸到糖酵解需要ENO1，这对于增强氧化应激和炎症反应具有重要意义。在人结肠癌Caco-2细胞中，新型冠状病毒感染会强烈诱导糖酵解，而使用其抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)阻断该途径会显著降低新型冠状病毒复制。因此，结果表明，抗炎过程也在新冠肺炎儿童中强烈触发。

在代谢产物组合中，与健康儿童或新冠肺炎成人相比，所有5种代谢产物在新冠肺炎儿童中均显著上调(图3N-O)。DHOA参与嘧啶代谢，DHOA的分泌可减轻缺氧时糖代谢重编程的毒性。TRP可被代谢为其他吲哚类化合物，如IAAld。TRP的下游产物，如KYN及其中间体，是AhR的激动剂，后者有助于免疫抑制和限制炎症。特别是，KYN在新冠肺炎儿童中的表达低于健康儿童，但远高于新冠肺炎成人，这表明在新冠肺炎儿童中AhR仍然活跃，新型冠状病毒诱导的免疫应答/炎症过程仍在控制之下。

此外，已发现甘露醇是一种羟基自由基清除剂，在减轻炎症方面发挥重要作用。此外，MMA是一种二羧酸，主要是丙酸盐代谢的副产物。研究表明，循环MMA水平升高导致SOX4表达上调，从而促进转录重编程。MMA在免疫反应和炎症调节中的作用还有待深入分析。除了5种优先代谢产物外，我们还发现其他代谢产物也有可能缓解恶化的炎症。例如，尿酸(UA)是嘌呤分解代谢的终产物，是血液中的主要抗氧化剂，有助于防止自由基氧化损伤。新冠肺炎儿童的UA血浆水平比新冠成人高109倍。

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表1.

总之，本次研究发现表明，与健康儿童或新冠肺炎成人相比，新冠肺炎儿童循环系统中免疫反应/炎症过程和保护性抗氧化或抗炎过程均显著升高。与此相一致，新冠肺炎儿童的临床数据显示，凝血指标如APTT、PT和D-dimer的水平，免疫细胞激活状态如CD3+CD4+和CD3+CD8+的比例，以及炎症因子如INF-γ和IL-1β的水平，一般都在正常范围内(表1)。

NO.4

冠状病毒感染时分子功能炎症

对于蛋白组合，使用qRT-PCR方法，在有或无冠状病毒感染的细胞中测量了它们的mRNA表达变化。使用小鼠肝炎病毒(MHV，A59株)感染大鼠肺上皮L2细胞。感染后12小时，提取细胞总RNA，并分别检测每种蛋白的mRNA表达。与蛋白质组学数据一致，MHV感染导致F9、F11、FGA和FGG mRNA水平显著升高，ENO1 mRNA表达显著降低(图4A)。

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图4.验证实验

对于代谢产物组合，在MHV感染的背景下，单独利用了它们对病毒复制和炎症的功能影响。未对IAAld进行探查，因为它是TRP的下游产物，其生物学影响与TRP相似。对于其余4种代谢产物中的每一种，采用CCK-8法测定不同浓度下L2细胞中的50%细胞毒性浓度(CC50)。所有4种代谢产物的CC50值均大于1280μM，表明这些代谢产物的细胞毒性较低。

然后对浓度为5或10μM的4种代谢产物中的一种或每种，L2细胞预处理1小时，然后用MOI为0.1的MHV病毒感染。感染后12 h提取细胞总RNA，用qRT-PCR检测病毒RNA累积量及IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-10等5种炎性细胞因子mRNA水平。从结果中，发现两种代谢产物，MMA和甘露醇，而不是DHOA或TRP，显著降低了MHV的RNA累积水平(图4B-E)。

此外，发现这4种代谢产物可以降低MHV感染细胞中至少一种炎性细胞因子的mRNA表达(图4F-I)。例如，MMA预处理1 h可显著降低IL-6、TNF-α和TGF-β的mRNA表达(图4F)，而DHOA或甘露醇治疗均下调IL-6和IL-1β(图4G，I)。TRP预处理仅下调IL-6 mRNA表达(图4H)。

总之，验证实验不仅验证了新型冠状病毒感染后可能真正改变的蛋白质，还揭示了一些代谢产物在抑制病毒复制和炎性细胞因子方面的保护作用。

在该模型中，与新冠肺炎成人相比，参与凝血级联反应的血浆蛋白在新冠肺炎儿童中的表达明显更高，这表明新冠肺炎儿童中新冠肺炎相关的凝血和伴随的免疫反应/炎症可能非常活跃。另一方面，与新冠肺炎成年人相比，新冠肺炎儿童炎症和氧化的许多负性调节因子，如MMA、色氨酸、吲哚乙酸、二羟色胺、甘露醇和尿酸的水平也显著上调，表明存在拮抗作用。

因此，新冠肺炎儿童的免疫系统处于相对平衡的状态，其激活比新冠肺炎成人更强，足以限制新型冠状病毒感染以及附带损害。同时，参与抗氧化和抗炎过程的分子在新冠肺炎儿童中也被强烈激活，从而防止炎症的恶化和疾病的恶化。

研究中的不足之处

1.在中国新冠肺炎疫情爆发早期采集新冠肺炎儿童血浆样本。当时，新冠肺炎儿童住院人数有限。因此，本研究的样本量相对较小；

2.尽管使用健康儿童和健康成人的数据进行归一化，但儿童和成人之间的内在差异可能未被完全排除；

3.iBM通过计算确定了两种最佳生物分子组合的优先级，其中计算了总RMSE值，以估计和减少预测偏差。然而，对于最终确定的模型，可能无法完全避免过度拟合；

4.研究表明，基于蛋白质组学的发现在不同研究中具有高度可变性。许多因素可能会对最终结果产生很大影响；

5.尽管进行了实验以验证本研究中基于组学的预测，但预计，需要从多个中心招募更多新冠肺炎儿童血浆样本将有助于进一步验证发现；

6.需要进一步研究在新冠肺炎儿童中特异性改变的蛋白质和代谢产物的作用，代谢产物是否可作为临床治疗药物也有待进一步分析。