Cell | 新冠后遗症重大发现！单细胞多组学揭示新冠后遗症的免疫学特征

中科新生命蛋白代谢多组学

2022.7.12

许多新冠患者会出现COVID-19相关的急性后遗症（post-acute sequelae of COVID-19，PASC），常见的如记忆丧失、胃肠痛、疲劳、嗅觉丧失、呼吸障碍等，甚至出现哮喘、心血管疾病等严重病症。近两年，新冠后遗症越来越受到关注，然而相关联的免疫系统的变化仍不清楚。

2022年3月，由美国西雅图系统生物学研究所James R. Heath联合多家单位在Cell上发表题为“Multiple early factors anticipate post-acute COVID-19 sequelae”的文章，该研究通过单细胞测序、蛋白组、代谢组等多组学联合方法对209名出现新冠后遗症的患者进行深入研究，探究新冠不同程度后遗症相关的变化。发现COVID的后遗症发生与四个先期风险因素密切相关：II型糖尿病、血液中SARS-CoV-2 RNA水平、EBV感染水平和特异性自身抗体。

研究对象

209例新冠后遗症患者，457名健康对照

技术路线

步骤1：描绘新冠后遗症研究队列的基本情况；

步骤2：分析自身抗体和新冠特异性抗体与后遗症的关联；

步骤3：利用单细胞TCR测序分析后遗症患者T细胞分群特征;

步骤4：进一步分析患者的新冠特异性T细胞在单细胞水平特征;

步骤5：单细胞测序揭示出新冠后遗症患者的四种免疫应答类型。

研究结果

1. 新冠相关后遗症统计学特征及蛋白组和代谢组标志物

作者利用两个队列研究新冠后遗症（Post-acute sequelae of COVID-19，PASC）。INCOV队列入组了209名新冠后遗症患者和457名健康对照，患者在新冠确诊（T1期）、急性期（T2期）、发病后2-3个月恢复期（T3期）记录临床特征并取样分析。另有HAARVI队列作为验证人群。主要后遗症类型有呼吸疾病（42%）、神经疾病（25%）、嗅觉/味觉丧失（18%）、胃肠道疾病（9%）等。新冠还可能导致先前潜伏的病毒再度激活。

通过进一步分析，发现新冠后遗症的发生与患者的性别（sex）、年龄、疾病严重程度以及是否伴有自身免疫相关的疾病等密切相关。研究者通过对血浆的蛋白组和代谢组分析，找到了新冠后遗症相关的生物标志物。皮质醇和皮质酮水平降低的患者易出现呼吸道相关后遗症，负调控昼夜节律和睡眠周期相关蛋白升高易出现神经系统症状。

图1 新冠后遗症研究队列情况

2. 自身抗体和新冠特异抗体与新冠后遗症的关联

先前报道显示自身抗体异常是新冠死亡和后遗症的风险因素，因此本文分析了新冠后遗症患者体内6种自身抗体和9种新冠病毒特异抗体的滴度变化。结果显示，后遗症患者自身抗体的检出率在T1期和T3期分别达到56%和44%，而这些人群在患新冠前仅有6%有自身免疫问题，表明两者间存在一定的关联。此外，神经相关后遗症的抗核壳蛋白IgG更高，胃肠道后遗症、咳嗽和多痰患者病情与抗IFN-α2等自身抗体正相关，这些抗体的早期滴度特征可作为预测新冠后遗症特定的生物标志物。

通过进一步分析显示，9种新冠特异抗体滴度相互间呈正相关，但新冠抗体与抗IFN-α2等6种自身抗体有不同程度的负相关，这种负相关可能推动了后遗症患者的免疫和炎症反应。抗IFN-α2自身抗体可通过中和IFN-α2信号，使得依赖IFN的B细胞反应失调，限制病毒特异性抗体的产生；对IFN-α2信号的抑制还会促进IFN-γ、CRP、IL-6等促炎因子上调，使得自身抗体阳性的患者表现出更高水平的炎症反应。

图2 不同抗体的滴度变化与新冠后遗症的关联

3. 利用单细胞TCR测序分析T细胞分群及动态变化

T细胞受体（TCR）基因的特异性和多样性可以反映出免疫系统的应答变化，因此本文利用单细胞TCR测序，分析了患者CD8⁺和CD4⁺ T细胞的动态演变。单细胞TCR测序将CD8⁺和CD4⁺T细胞均分成了5个亚群，不同亚群丰度在T2期、T3期变化巨大，例如CD8⁺T细胞亚群1和亚群2均有细胞毒性T_EMRA细胞样特征，但亚群1在T2期占主导，亚群2在T3期占主导。从细胞亚群的基因表达特征来看，效应型记忆T细胞前体细胞亚群中，上调表达的基因参与了抑制炎症和防止T细胞过度激活，这种特异性表达会影响细胞亚群演变及后遗症的形成。此外，研究者注意到胃肠道后遗症的患者，其CD4⁺第4亚群（细胞毒性T细胞）在T3期富集，该亚群与后遗症同样存在关联。

图3 单细胞测序显示的T细胞亚群变化及基因表达变化

4. 不同后遗症患者的SARS-CoV-2特异性T细胞存在演化差异

研究者进一步分析了特异性识别新冠病毒的T细胞的基因表达情况。首先通过MIRA技术（TCR抗原特异性多重鉴定）找到新冠抗原表位，再利用CITE-seq技术标记识别对新冠病毒亲和的CD8⁺T细胞，并在单细胞水平分析这些细胞的特征。结果表明，胃肠道后遗症病人的新冠特异CD8⁺T细胞在T2急性期呈现未分化状态，而在T3期则表现出更多的细胞毒性T细胞特征。相比之下，有呼吸道后遗症的患者，其新冠特异性T细胞的变化则是相反的趋势。以上结果表明胃肠道和呼吸系统后遗症的病因可能不同。

图4 sc-CITE-seq单细胞测序显示新冠特异性T细胞的特征

5. 免疫细胞单细胞转录组揭示了新冠后遗症患者的四种免疫应答类型

综合以上对免疫细胞在单细胞水平的分析结果，研究者将新冠后遗症患者的免疫应答类型分为4组。第一组，CD4⁺T细胞具有Th₁样免疫反应特征，单核细胞具有M1极化的促炎特征，CD8⁺T细胞和NK细胞具有细胞毒性特征，B细胞具有记忆细胞特征。第二组的特征则相差较大，CD4⁺T细胞为Th₂样特征，单核细胞为M2极化的抗炎特征。第三组为中间型，其免疫细胞变化特征介于第一组和第二组之间。第四组（naive组）表现出Naive T细胞和B细胞状态，NK细胞处于静息状态。其中，第二组的住院率更高，提示其免疫状态可能不利于清除新冠病毒。

图5 PASC后遗症患者的4种免疫应答类型

小编小结

目前，关于新冠的后遗症受到了极大的关注，但引起新冠后遗症的因素，尤其是免疫学方面的认知，仍存在较大的空白。本研究针对209例新冠后遗症患者较为系统地分析了患者免疫相关变化。通过单细胞多组学联合，系统展示了免疫细胞在确诊初期、急性期和恢复期的细胞亚群变化和对应的基因表达变化，并发现了不同亚群细胞与对应后遗症的联系，最后揭示了新冠后遗症患者的四种免疫应答类型。本研究为新冠后遗症的早期诊断和预测指出了新的方向，为研究新冠后遗症的形成机制提供了关键线索。

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