新冠病毒检测有了新方法，可一次联合检测多种新冠变异株

融智生物

2022.1.11

基于QuanNUA基因分型系统开发的用于SARS-CoV-2变异株分型检测的方法，可同时检测新冠毒株S基因7个突变位点9种突变分型用于新冠病毒及其变异毒株检测。

该方法充分利用核酸质谱技术的多位点检测优势，准确性高，适用于新冠变异株分型检测；同时，该方法可实现样本的高通量快速检测，检测周期短，从PCR扩增到质谱检测，7h内可完成96份样本的检测；而且，该方法灵活性高，当出现新型新冠突变株时，可在现有检测方案中添加特异性探针用于新增突变位点检测。

该方法是为新冠病毒变异株分型提供一种快速、高通量，高准确度的新型检测方法。

自2019年以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）已在全球范围内传播。SARS COV-2病毒变异株的出现，使全球面临第二波冠状病毒疾病流行的危机。截至到2021年6月，SARS-CoV-2变异株主要有6种分型，包括B.1.1.7 (Alpha), B.1.351 , (Beta), B.1.429 (Epsilon), B.1.526 (lota), P.1 (Gamma) 以及 B.1.617.2 (Delta)变异株^[1-2]。有研究表明，这些新冠变异株在SARS冠状病毒S蛋白的受体结合域（RBD）中发生关键性突变，病毒的传播效率增强，感染者临床症状更为严重，病毒的免疫逃逸能力增强，并且降低当前疫苗的免疫效果^[3-4]。目前新冠变异株检测的金标准方法是WGS测序技术^[5]，但是该技术检测成本高、检测周期长，技术要求高，不适合大规模常规样本筛选。qPCR技术、melting-temperature RT-PCR 技术以及基于CRISPR-Cas13a转录扩增技术^[6-8]一般只适用于新冠变异株单个位点检测。因此，有必要开发一种快速、准确、经济并且适用于多位点检测的技术应用于当前新冠突变株的分型检测。本研究开发了一种基于多重PCR和MALDI-TOF MS联用技术用于SARS-CoV-2变异株分型检测的方法。

本研究开发了一种基于多重PCR和QuanNUA（MALDI-TOF MS）的方法用于SARS-CoV-2变异株分型检测，实现在新冠毒株S基因检测7个突变位点包括9种突变分型（HV6970del, N501Y, K417N, P681H, D614G, E484K, L452R, E484Q 和 P681R)用于 India (B.1.617)、UK (B.1.1.7)、 South African (B.1.351)、 California (B.1.429)、 New York (B.1.526)、 Brazilian (P.1)等6种新冠变异株的分型检测。实验内容主要包括三部分：首先，使用核酸提取试剂盒对临床样本进行病毒RNA提取，并基于RT-PCR技术扩增含SNP靶位点的目的基因；然后，通过特异性质量探针进行SNP位点延伸；最后，通过MALDI-TOF MS技术鉴定不同质量探针分子量得到目的基因检测结果(图1)。

图1▲基于多重PCR和MALDI-TOF MS技术用于SARS-CoV-2变异株分型检测的流程图

使用QuanNUA基因分型系统检测样本的基因分型，该系统由融智生物提供，包括引物设计软件、试剂盒、MALDI-TOF MS和操作软件。检测主要流程包括核酸反应产物制备和MALDI-TOF MS检测。

制备核酸反应产物

核酸样本的制备过程中所需试剂和酶主要来源于融智生物提供的核酸检测试剂盒，制备过程主要分为四步：多重RT-PCR扩增、虾碱性磷酸酶消化(SAP)、质量探针延伸(MPE)和树脂纯化。1）使用AgPath-ID 一步法RT-PCR试剂盒，对提取RNA核酸样本进行反转录后多重PCR扩增;2）在PCR反应结束后，将 PCR 产物用SAP处理，以去除反应体系中游离的dNTPs;3）加入MPE探针用于待检测位点单碱基延伸反应；4）加入离子交换树脂用于除盐纯化。

MALDI-TOF MS检测

核酸反应产物溶液经树脂纯化后，离心取上清液。靶板上点样，靶板通过QuanTOF控制器软件自动加载进质谱仪。通过QuanNUA基因分型系统软件，自动采集数据，并基于QuanNUA基因分型系统软件对延伸位点的基因分型进行分析判读并输出检测报告。
本研究开发了一种基于多重PCR和QuanNUA（MALDI-TOF MS）的方法用于SARS-CoV-2新冠变异株分型检测(表1)。该方法对SARS-CoV-2非变异株和变异株质粒均可检测到明显的质量探针延伸峰(图2)，同时应用于21例呼吸道病原体（9种细菌和12种呼吸道病毒）和非新冠感染病人的核酸样本检测，均未检测到延伸峰，该方法具有良好的特异性；使用合成质粒评估方法检出限，方法最低检出限在100-400拷贝，使用SARS-CoV-2非突变RNA核酸样本稀释液用于方法检出限测定，方法最低检出限为1560拷贝；应用于20例临床样本的检测，检测结果如表2所示，与q-PCR和WGS测序结果进行比对，对于q-PCR Ct值< 27的阳性样本，基于QuanNUA核酸质谱建立的方法进行检测，所有待测位点全部检出，与qPCR结果全部一致，3例delta突变株可正确鉴定，说明该方法具有良好的鉴定准确性，并可应用于临床样本的新冠变异株分型检测。

表1▲

用于SARS-CoV-2变异株分型检测靶点的质量探针

图2▲

SARS-CoV-2变异株分型检测所用质量探针延伸前(a)、SARS-CoV-2非变异株延伸后(b)、SARS-CoV-2突变质粒（含HV69-70del, K417N, E484K, N501Y, D614G 和 P681H突变位点）延伸后(c)和SARS-CoV-2突变质粒（含L452R, E484Q, 和P681R突变位点）延伸后(d)的质谱图

表2▲基于多重PCR和QuanNUA的方法用于临床样本中SARS-CoV-2变异株分型检测Note:BALF,bronchoalveolarlavagefluid;NPS,nasopharyngeal swab
基于QuanNUA基因分型系统开发的用于SARS-CoV-2变异株分型检测的方法，可同时检测新冠毒株S基因7个突变位点上包括HV69-70del (Alpha), N501Y (Alpha, Beta和Gamma)、K417N (Beta), P681H (Alpha)、D614G (Alpha, Beta, Gamma, Epsilon, lota和Delta)、E484K (Beta和Gamma)、L452R (Delta和Epsilon)、P681R (Delta)和E484Q (B.1.617.1和B1.617.3)等9种突变分型用于SARS-CoV-2及其变异毒株检测。该方法充分利用核酸质谱技术的多位点检测优势，准确性高，适用于新冠变异株分型检测；同时，该方法可实现样本的高通量快速检测，检测周期短，从PCR扩增到质谱检测，7h内可完成96份样本的检测；而且，该方法灵活性高，当出现新型新冠突变株时，可在现有检测方案中添加特异性探针用于新增突变位点检测。

该方法是为新冠病毒变异株分型提供一种快速、高通量，高准确度的新型检测方法。

参考文献

1. Tang JW, Tambyah PA, Hui DS. 2021. Emergence of a new SARS-CoV-2 variant in the UK. J Infect 82:e27–e28.

2. Cascella M, Rajnik M, Aleem A, Dulebohn SC, Di Napoli R. 2021. Features, evaluation, and treatment of coronavirus (COVID-19). StatPearls, Treasure Island, FL.

3. Galloway SE, Paul P, MacCannell DR, Johansson MA, Brooks JT, MacNeil A, Slayton RB, Tong S, Silk BJ, Armstrong GL, Biggerstaff M, Dugan VG. 2021. Emergence of SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage—United States, December 29, 2020–January 12, 2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 70:95–99.

4. Khan A, Zia T, Suleman M, Khan T, Ali SS, Abbasi AA, Mohammad A, Wei DQ. 2021. Higher infectivity of the SARS-CoV-2 new variants is associated with K417N/T, E484K, and N501Y mutants: an insight from structural data. J Cell Physiol 236:7045–7057.

5. Umair M, Ikram A, Salman M, Khurshid A, Alam M, Badar N, Suleman R, Tahir F, Sharif S, Montgomery J, Whitmer S, Klena J. 2021. Whole-genome sequencing of SARS-CoV-2 reveals the detection of G614 variant in Pakistan. PLoS One 16:e0248371.

6. Durner J, Burggraf S, Czibere L, Tehrani A, Watts DC, Becker M. 2021. Fast and cost-effective screening for SARS-CoV-2 variants in a routine diagnostic setting. Dent Mater 37:e95–e97.

7. Banada P, Green R, Banik S, Chopoorian A, Streck D, Jones R, Chakravorty S, Alland D. 2021. A simple RT-PCR melting temperature assay to rapidly screen for widely circulating SARS-CoV-2 variants. medRxiv.

8. Wang Y, Zhang Y, Chen J, Wang M, Zhang T, Luo W, Li Y, Wu Y, Zeng B, Zhang K, Deng R, Li W. 2021. Detection of SARS-CoV-2 and its mutated variants via CRISPR-Cas13-based transcription amplification. Anal Chem 93:3393–3402.