学术前沿！Nat Commun蛋白质组学+磷酸化蛋白质组学揭示中国食管鳞癌2大亚型及靶向干预研究成果

吉凯基因

2021.10.14

近年来，肿瘤分子分型如火如荼的开展。肿瘤的分子分型是实现肿瘤精准治疗的基础。乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌和结直肠癌等肿瘤的分子分型已用于临床。这些肿瘤分子分型多通过基因、转录、蛋白等分子维度特征将肿瘤分为几个亚型，从而为精准治疗提供适合的患者群体。

食管癌(EC)是一种侵袭性癌症，没有临床相关的分子亚型，阻碍了有效治疗策略的发展。近期，汕头大学医学院潮汕沿海地区高发肿瘤分子生物学广东省高校重点实验室、基础医学研究所的李恩民教授/许丽艳研究员课题组与厦门大学药学院、应激细胞生物学国家重点实验室的刘文教授课题组在Nature Communications杂志上以“Large-scale and high-resolution mass spectrometry-based proteomics profiling defines molecular subtypes of esophageal cancer for therapeutic targeting。“为题在线发表了研究论文。该研究从多维组学层面全面揭示了食管癌中失调蛋白、磷酸化修饰位点及相关信号通路，发现了食管癌中具有显著生存差异的两个亚型，预测了针对高风险亚型的药物，并验证了药物的有效性，为指导食管癌患者的治疗决策和药物开发提供了新的思路。

研究结果

食管癌(EC)的大规模蛋白质组学

和磷蛋白质组学分析

对124对EC癌及癌旁组织(队列1)进行了TMT的蛋白质组学分析，共鉴定出14252个蛋白，至少一半的样品和所有样品中分别有9300和6468个蛋白质是可量化的。主成分分析和层次聚类表明，癌及癌旁可以很好地分离。对31对癌及癌旁食管组织进行了label free磷酸化蛋白组学研究，总共在7943个蛋白中鉴定了73,651个磷酸化位点，其中67393个磷酸化位点是可量化的。定量的蛋白质和磷酸化蛋白质亚细胞分布发现它们大部分主要分布在细胞核、质膜、细胞质、线粒体和细胞外间隙，与以往的报告一致。

蛋白质组学分析鉴定了异常蛋白和通路

为进一步识别在癌和癌旁样本之间差异表达的蛋白质，在可量化的9300个蛋白中，肿瘤蛋白中分别有4125(44.4%)和3140(33.8%)显著上调和下调。在至少一半样本中可量化的61,471个磷酸化位点中，3932个(6.4%)和3002个(4.9%)在肿瘤中分别显著上调和下调。绝大多数磷酸位点的倍数变化大于相应蛋白水平的倍数变化。差异蛋白组学分析发现，食管癌中大量蛋白差异表达，导致众多信号通路显著失调，包括EMT、DNA replication、cell cycle、E2F targets、G2/M checkpoint等的上调，以及drug metabolism、fatty acid metabolism和oxidative phosphorylation等的下调。同时，磷酸化蛋白组学分析也揭示了食管癌中过度磷酸化修饰的通路，如Cell cycle和spliceosome等，以及低磷酸化修饰的通路，如Tight junction和Adherence junction等。磷酸化蛋白质组学数据补充了蛋白质组学食管癌的认识。同时也对比了文献中报道的突变基因，蛋白质组学和基因组改变之间的联系和不一致为解释EC的发病机制提供了有价值的线索。

蛋白质组学分析将患者分为两个亚型，

低危S1亚型和高危S2亚型

研究者试图研究肿瘤样本是否可以根据我们的蛋白质组学分析分层为临床相关的分子亚型，采用共识聚类法对最具变异的前25%的蛋白进行聚类，确定了两个主要亚型S1和S2亚型。S1和S2亚型分别包含61和63个肿瘤样本。与S1亚型患者相比，S2亚型患者的OS和无病生存(DFS)预后更差。S1和S2差异表达蛋白的热图分析显示，S2亚型表现出极端表达模式；上调蛋白的表达量非常高，下调蛋白的表达量非常低。

在EC中鉴定出ELOA和SCAF4组成

的亚型诊断特征

为识别可能在临床环境中可用的亚型诊断特征，将特征的最大数量设置为1、2、3或4进行选择，以最大ROC曲线下面积(AUC)为标准，识别出 “ELOA, SCAF4”表现出良好的预测性能。在S2亚型中，ELOA和SCAF4的表达均显著高于S1。构建以ELOA和SCAF4为特征的SVM分类模型对124例患者(队列1)进行预测，AUC为0.976。为了进一步验证亚型诊断模型，免疫组化(IHC)对EC患者(队列2,n=295)的ELOA和SCAF4的表达进行了检测，与S1亚型相比，S2亚型的ELOA和SCAF4染色较强。通过该模型，预测97例患者为S1亚型，198例患者为S2亚型。Kaplan-Meier曲线显示，S2亚型患者的OS更差和DFS结局，说明我们构建的亚型诊断模型能够准确预测EC亚型。

基于分子亚型的EC药物预测和验证

为了寻找EC患者的治疗策略，针对癌与癌旁，S1与S2亚型之间的差异表达的蛋白通过与Connectivity Map (CMAP)数据库进行匹配，筛选到了6种候选药物，其中以GW8510、menadione和sulconazole最好。通过菌落形成实验进一步证实了这三种药物对细胞生长的影响，动物实验进一步验证了药物效能。

为了验证这三种药物对EC细胞生长的影响，是否与它们对S1和S2亚型差异表达蛋白的调节有关，对KYSE150细胞在药物治疗后进行了蛋白质组学分析。研究发现这三种药物对S1和S2亚型中差异表达的绝大多数蛋白质都表现出了显著的影响，GW8510、menadione和sulconazole可作为S2亚型EC患者靶向S2亚型异常蛋白的潜在药物。

结论

此项研究揭示了EC肿瘤中调控异常的蛋白和通路，并据此定义了两个临床相关的分子亚型S1和S2，并且ELOA和SCAF4两个蛋白的表达水平能区分S1和S2亚型，构建了ELOA和SCAF4组成的诊断和预后亚型特征。研究还针对两种亚型之间的差异蛋白质，提供了潜在治疗更具侵袭性的S2亚型患者的三种药物Menadione，GW8510和Sulconazole。这些研究结果拓展和加深了对食管癌分子致病机制的解析，为推进食管癌的分层治疗和药物开发开辟了新方向。

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