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Cell metabolism（IF 27.3）| 饥饿疗法，代谢流助力揭示肿瘤的代谢脆弱性

中科新生命蛋白代谢多组学

2021.12.24

代谢重编程是肿瘤的一个标志现象，越来越多的证据表明细胞代谢的重编程支持了肿瘤的发生、进展、转移和耐药。近年随着代谢组学技术的发展，尤其是代谢流技术，极大的提升了对于肿瘤代谢异质性的理解。在此基础上，研究者们针对肿瘤新陈代谢提出了相关的治疗策略，如饮食控制、代谢酶抑制/激活等，也已经取得了积极的进展。

2020年2月，来自纽约大学医学院的研究团队在Cell metabolism（IF 27.3）发表题为“Activation of Oxidative Stress Response in Cancer Generates a Druggable Dependency on Exogenous Non-essential Amino Acids”的报道，研究者团队主要利用代谢流技术，阐明了Keap1突变型肿瘤中因代谢重编程发生的外源非必需氨基酸（NEAAs）依赖性的机制，及其对于肿瘤发生发展的意义，提出并验证了潜在的靶向代谢治疗策略。

研究材料

细胞、小鼠模型

技术路线

步骤1：利用代谢组及代谢流描绘代谢重编程表型；

步骤2：阐明验证发生机制及靶点挖掘；

步骤3：提出代谢靶向治疗策略。

研究结果

1. 研究背景介绍

NFE2L2(简称Nrf2)是细胞抗氧化反应的主要转录调节因子，控制过多条参与活性氧(ROS)解毒的基因转录。在正常情况下，Nrf2被隔离在细胞质中，通过与Kelch-like ECH-associated protein 1(简称Keap1)互作，不显示活性。当细胞中ROS积累，Keap1构象变化，Nrf2移位到细胞核促进相关靶基因转录。在KRAS驱动的非小细胞肺癌(NSCLC)中，大约20%的类型存在Keap1或Nrf2突变，是主要的治疗靶点。此外，Keap1/NRF2抗氧化信号通路的突变在几种实体癌症中是常见的事件，通常均与患者的不良预后有关。

2. 代谢重编程表型描绘

研究者在体内及体外实验中发现Keap1突变型肿瘤对外源NEAAs的摄取增多，尤其是当天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸这三种外源NEAAs耗尽时，Keap1突变型肿瘤出现明显的生长抑制现象，但WT型肿瘤细胞并未受到影响，研究者推测这一现象可能是Keap1突变后肿瘤细胞出现代谢重编程，导致对NEAAs的需求增加或者合成NEAAs的能力减弱，从而产生了对外源NEAAs的依赖性。

图1 外源丝氨酸、甘氨酸和天冬氨酸耗尽后出现显著生长抑制

使用[U-13C]glucose和[U-13C]glutamine作为同位素底物标记细胞后，通过代谢流技术对氨基酸合成相关通路进行分析，发现两种肿瘤对于丝氨酸的合成速率几乎一致，但Keap1突变型细胞中的丝氨酸含量几乎是WT肿瘤细胞的3倍，绝大部分来自外源。另外，Keap1突变型细胞中天冬酰胺几乎都依靠外源摄入。以上结果说明相比WT细胞，Keap1突变型肿瘤内部经过代谢重编程后，对于NEAAs需求量增大，同时合成能力不足以支持这种需求，这与产生外源NEAAs依赖性表型是一致的。

图2 代谢流分析氨基酸合成通路及内外源组成比例

3. 代谢重编程机制讨论及靶点挖掘

（1）重编程意义讨论及机制验证

研究者通过激活Nrf2和给予细胞高氧化环境等手段，证明对外源NEAAs的依赖性由Nrf2激活所引导，是一种针对肿瘤细胞内部高ROS积累环境的适应机制，当处于外源NEAAs耗尽环境时，Keap1突变型细胞会出现明显生长抑制。

图3 Nrf2介导的氧化应激作用

（2）靶点挖掘

谷氨酸是NEAAs合成通路上的重要节点代谢物，结合已有研究与实验验证，研究者首先确认了Keap1突变型细胞生长受到细胞内谷氨酸含量的调控。

另一方面Keap1突变型细胞展现出对外源丝氨酸缺乏的敏感性，研究者讨论了丝氨酸缺乏对于肿瘤细胞生长的抑制机制，发现核苷酸合成受阻是主要限制了Keap1突变细胞生长的主要原因。

为了探索Keap1突变型细胞内丝氨酸缺乏的原因，研究者用[U-13C]glucose标记Keap1突变型细胞，使用代谢流检测当丝氨酸耗尽时，从头合成通路的流量，发现相比WT细胞，Keap1突变型细胞中TCA循环的葡萄糖流量没有增加，另外谷氨酰胺进入TCA循环的流量也没有变化，表明Keap1突变型细胞中糖酵解相关前体的可用性没有减少。

图4 代谢流揭示丝氨酸合成通路流量变化

丝氨酸合成另一个关键节点是由谷氨酸与磷酸羟基丙酮酸(PHP)经催化，生成丝氨酸。这种转氨基反应是由磷酸丝氨酸转氨酶(PSAT)催化的。研究者在丝氨酸缺乏的情况下，向Keap1突变型细胞提供谷氨酸，发现细胞生长速率获得恢复。通过构建PSAT基因敲除的WT和Keap1突变肿瘤细胞，验证了这种能力依赖于PSAT的存在。

使用[α-15N] glutamine标记细胞，以确定谷氨酸氨基的代谢流向。发现外源丝氨酸耗尽时，细胞中增加15N标记的丝氨酸和甘氨酸比例上升。此外，还发现在缺乏丝氨酸的条件下，Keap1突变型细胞中15N标记的掺入减少，这表明Keap1突变细胞中谷氨酸可获得性的降低减少了丝氨酸的合成。用Nrf2的小分子激活剂处理Keap1 WT细胞，同样导致15N标记在丝氨酸和甘氨酸中的掺入减少。这证明在Keap1突变型细胞中丝氨酸的合成受到谷氨酸含量的调控，可以通过补充谷氨酸来恢复丝氨酸的合成。

图5 谷氨酸含量下降引发丝氨酸、甘氨酸合成减慢

4. 针对代谢异质性的潜在治疗策略

在上述基础上，针对代谢异质性，研究者提出了两种靶向代谢治疗策略，一种是利用肿瘤细胞对丝氨酸、甘氨酸的敏感性，设计了丝氨酸和甘氨酸饮食摄入限制、天冬酰胺饮食限制、天冬酰胺酶注射等三种干预策略，通过动物模型验证发现以上策略均能明显抑制Keap1突变型肿瘤生长，其中使用天冬酰胺酶注射+天冬酰胺饮食限制联合策略会强烈抑制肿瘤生长，但WT型肿瘤细胞对这三种策略不敏感。

另一种是针对肿瘤对于谷氨酸缺乏的敏感性设计的策略，其中谷氨酰胺酶抑制剂CB-839和丝氨酸及甘氨酸饮食摄入限制联合治疗显著抑制了Keap1突变型肿瘤的生长，但令人惊喜的是，WT肿瘤的生长同样受到该策略的强烈抑制。