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空间代谢组 | 协和医学院科学家在用的原位表征肿瘤代谢方法

迈维代谢

2023.2.13

● 期刊：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

● 影响因子：12.779

● 发表时间：2019.01.02

中国医学科学院北京协和医学院药物研究所知名团队在《PNAS》上发表了一篇题为“Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations”的研究论文，建立了空间分辨的原位代谢组学方法，并提出一种“下游代谢物与上游代谢酶关联” 的研究策略来表征肿瘤代谢改变；结合IHC技术分析验证，从代谢物和代谢酶两个层次和组织原位深入探究食管癌的代谢改变，发现并可视化表征了食管癌异常的代谢通路及其代谢酶。

背景研究

代谢模式是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征，越来越多的研究表明，在肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤细胞会发生特定谱式的代谢改变以适应肿瘤生长。几乎所有的肿瘤都需要通过类似的代谢重编程（Metabolic Reprogramming）来维持其无限制的细胞增殖。肿瘤代谢的表征能够为癌症病理机制研究、肿瘤诊疗新指标和干预靶点的发现提供新的契机。然而，到目前为止，如何全面的发现肿瘤的异常代谢，尤其是如何从代谢物和代谢酶两个层面上原位地表征肿瘤的异常代谢仍然面临非常大的困难。

研究过程

作者将相邻的组织切片分别进行病理组织染色切片和质谱成像，其中病理切片可以区分组织中的癌症组织、上皮组织和肌肉组织。随后将病理图像和质谱图像重合后，随后利用a partial least squares discriminant analysis (PLS-DA)模型分别重合图像中的三组不同的组织，因此可以获得不同组织空间特定区域的代谢物的离子强度信息。随后作者将质谱成像中不同组织间存在明显差异的代谢物信息导入到Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库中，进行代谢通路的分析，作者筛选出了多个存在明显改变的代谢通路（精氨酸和脯氨酸代谢，脂肪酸合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，嘧啶代谢，组氨酸代谢），并分别选择了6组相关的关键代谢物和代谢酶进行分析验证。

实验设计

收集256例人鳞片状食管癌（ESCC）组织标本，包括癌组织、癌旁组织和远端非癌组织，制成冰冻组织切片。如图1所示，采用空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像技术（AFADESI-MSI），采集上述组织中内源性代谢物及其空间分布信息；对相邻切片进行HE染色；采用MassImager质谱成像数据处理软件，使质谱成像图与HE染色图匹配重合，按不同组织类型及空间分布提取代谢物轮廓信息；使用SIMCA软件进行多变量统计分析，筛选出与肿瘤代谢相关的差异代谢物；根据差异代谢物及其鉴定结果富集分析发生变化的代谢通路及推测关键代谢酶；采用免疫组化方法检测锁定的代谢酶表达，进一步验证其与代谢标志物是否具有同样的空间分布特征。

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图1 采用空间分辨的原位代谢组学研究策略，发现肿瘤代谢变化

实验结果

1. 脯氨酸生物合成上调

脯氨酸作为细胞微环境中的重要氨基酸参与细胞凋亡和自噬，在癌症代谢中的重要作用得到越来越多的关注。根据256个食管癌组织样本的统计数据，癌区脯氨酸离子强度显著高于上皮和肌肉区(P<0.001，图2C)。采用免疫组化方法检测与脯氨酸合成相关的关键代谢酶吡咯-5-羧酸还原酶2（PYCR2）在ESCC组织切片中的空间表达，发现PYCR2只在癌区表达(图2e)，与食管癌组织中脯氨酸的空间分布一致。

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图2 脯氨酸生物合成途径中关键代谢物和代谢酶的原位分析（A）脯氨酸的质谱成像（B）光学-MSI重叠图像（C）256例鳞片状食管癌（ESCC）患者癌组织和相邻上皮、肌肉组织中脯氨酸水平***p<0.001（D）ESCC组织的HE染色图（E）不同ESCC组织中PYCR2的表达CT，癌组织；ET，上皮组织；MT，肌肉组织。

2. 尿苷代谢上调

尿苷是RNA合成的重要核苷前体，也参与嘌呤核苷酸生物合成和碳水化合物代谢。此外，组织中尿苷的水平对于嘧啶类抗代谢药物的抗肿瘤治疗至关重要。研究发现癌组织中尿苷含量高于上皮组织而低于肌肉组织（P<0.001,图3 A1和A3），而尿嘧啶的含量在癌组织中显著升高（P<0.001,图3 A2和A4），尿嘧啶/尿苷离子强度比（图3A6）在癌区显著增加，可以作为区分癌组织与癌旁正常组织的生物标志物。同样，免疫组化结果显示催化尿嘧啶生成尿苷的代谢酶尿苷磷酸化酶1(UPase 1)在癌组织中的表达上调。

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图3A 尿苷代谢途径中关键代谢物和代谢酶的原位分析（A1，A2）尿苷和尿嘧啶的质谱成像图（A3，A4）256例鳞片状食管癌（ESCC）患者癌组织和相邻上皮、肌肉组织中尿苷和尿嘧啶水平***p<0.001（A5）UPase 1介导的尿苷转换为尿嘧啶的代谢过程（A6）根据尿嘧啶/尿苷离子强度比值构建的质谱成像图（A7）癌组织和相邻上皮、肌肉组织中尿苷和尿嘧啶的强度变化（A8）ESCC不同区域UPase 1的表达CT，癌组织；ET，上皮组织；MT，肌肉组织。

3. 组胺代谢下调

组氨酸在组氨酸脱羧酶(HDC)的介导下代谢为组胺。有越来越多的证据显示组胺直接参与致癌作用，可以作为一种潜在的细胞保护剂来改善癌症治疗。根据一些研究者的说法，基于组胺的治疗能促进癌细胞中DNA损伤、凋亡和衰老并可以显著增加患癌动物的存活率。在本研究中，组氨酸和组胺呈现完全相反的空间分布。根据256例食管癌组织样本的成像数据，组氨酸在癌组织中显著上调而组胺显著下调。组胺与组氨酸的离子强度差异如图3B7所示。通过计算组胺与组氨酸的离子强度比，对HDC介导的组氨酸脱羧反应进行了研究(3B6)，发现肿瘤组织的脱羧率相对于肌肉和上皮组织较弱。和基于强度比的质谱成像预测的一致，肿瘤组织的HDC表达水平低于肌肉组织和上皮组织。

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图3B 组胺代谢途径中关键代谢物和代谢酶的原位分析（B1，B2）组氨酸和组胺质谱成像图（B3，B4）256例鳞片状食管癌（ESCC）患者癌组织和相邻上皮、肌肉组织中组氨酸和组胺水平（B5）HDC介导的组氨酸转换为组胺的代谢过程（B6）根据组胺/组氨酸离子强度比值构建的质谱成像图（B7）癌组织和相邻上皮、肌肉组织中组氨酸和组胺的离子强度变化（B8）ESCC不同区域HDC的表达。

此外，发生改变的代谢途径还有谷氨酸代谢，脂肪酸合成以及多胺的生物合成，均在肿瘤组织中表现为显著增多，相应的免疫组化结果也证明与上述途径有关的关键代谢酶在癌区的表达也明显上调。以下（表1）为通过256例食管癌患者组织样本筛选出的发生改变的6条代谢途径和相应的关键代谢酶：

表1 筛选出癌症相关的代谢产物、代谢酶、代谢途径

研究结论

作者发现在癌症组织中的脯氨酸的离子强度要远高于上皮组织和肌肉组织，并且通过IHC技术分析了吡咯啉-5-羧酸还原酶2（PYCR2）蛋白的含量，发现PYCR2蛋白这种脯氨酸生物合成中的关键限速酶的表达量在癌症组织中也高于其他两个组织，说明在癌症组织中，脯氨酸代谢相比正常组织发生了明显的改变。在谷氨酸的代谢通路中，作者发现癌症组织中的谷氨酰胺（Gln）的离子强度低于上皮组织和肌肉组织，但在谷氨酸（Glu）的离子强度高于上皮组织和肌肉组织，暗示在癌症组织中Gln更容易代谢转化为Glu的，随后作者用IHC技术分析将Gln代谢水解为Glu的谷氨酰胺酶（GLS）的表达量，发现在癌症组织的表达量同样的高于正常组织。类似的，作者对另外的四个代谢通路中的代谢物（嘧啶、组氨酸、脂肪酸、精胺）在癌症组织和正常组织中的离子强度差异进行分析，随后根据代谢通路信息推导出关键的代谢酶，随后用IHC技术进行验证，分析癌症组织中相比正常组织中的代谢变化。总之，作者发展了一种在组织水平上具有空间分辨率的代谢组学质谱成像技术，可以高通量分析肿瘤组织中的代谢变化，为寻找肿瘤中可能的靶向代谢通路提供了更多信息。

科研延伸

质谱成像(MSI)已被证明是一种用于绘制生物组织中分析物的强大工具。通过将质谱的无标记特异性添加到传统组织学的详细空间信息中，数百种代谢物可以在肿瘤内同时成像。MSI提供高度详细的代谢物图，可用于比较肿瘤内、肿瘤边缘和健康区域，识别生物标志物、疾病模式和潜在的治疗靶点，研究药物作用靶点、传输途径等。迈维代谢提供空间代谢组学检测技术。

迈维代谢采用MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight MS)技术进行空间代谢组检测。

技术优势：

(1)高空间分辨率：无与伦比的5微米像素(亚细胞级别);

(2)高质量分辨率及灵敏度：高灵敏度、高分辨地获得待测样本中目标分子的精准时空分布，准确可视化该分子质量的化合物。
(3)检测物质多样：拥有业界最全数据库，能够对目标或者非目标分析物进行成像分析。

(4)扫描速度快，定量稳定性高。

(5)定性准确性高，拥有业界首个空间代谢组数据库。
(6)可根据需求进行个性化实验。