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临床研究专题｜样本量如何计算？本文一看便知
对于代谢组而言，目前较为容易开展的临床研究类型是观察性的横断面研究，即通过代谢组找到与某种疾病相关的代谢标志物，后续进行疾病的诊断或开展一些基础的机制研究工作。因此接下来跟大家分享下横断面研究的方案设计、样本量计算以及样本纳排标准。
方案设计
首先来看两个案例：
● 期刊：Gastroenterology
● 发表时间：2019
● 影响因子：19.819
研究思路
① 发现阶段1对于360名受试者进行高通量代谢组检测，筛选到30个差异代谢物；
② 发现阶段2对于1594名受试者进行高通量检测，筛到7个与发现阶段1中共有的差异代谢物，然后通过二元逻辑回归分析得出2个潜在biomarker；
③ 建模阶段对于900名受试者（来源于发现阶段2 ）进行2个biomarker的靶向检测，并构建了诊断模型；
④ 验证阶段对于1528名受试者进行2个biomarker的靶向检测，验证了模型的诊断效能。
● 期刊：Gut
● 发表时间：2021
● 影响因子：19.819
研究思路
① 发现阶段对于92例受试者血清进行高通量代谢组检测，并选择与血清匹配的44例粪便样本进行宏基因组检测，经联合分析共识别到与肠道微生物组相关的代谢产物322种，使用 LASSO算法筛选并鉴定得到8个代谢物；
② 建模阶段对于72例正常个体和120例结直肠异常患者，使用靶向方法测量8种代谢物的丰度，并用逻辑回归方法生成预测模型；
③ 验证阶段对于验证队列中103例结直肠异常患者和53例健康个体进行8种代谢物的靶向检测，已评估此模型的预测性能。
通过以上两篇经典案例我们不难发现，代谢组biomarker筛选流程通常包含三个阶段：①发现阶段，在发现队列中通过高通量代谢组筛选出候选biomarker；②建模阶段，在建模队列中通过靶向方法检测筛选到的biomarker，并构建判别模型；③验证阶段，在验证队列中靶向检测biomarker，以验证模型判别效能。
那我们在代谢组文章中经常看到的发现集、训练集、验证集和测试集分别是指的哪个阶段呢？
这几个词汇其实是来源于机器学习的过程。在机器学习中，一般将样本分成独立的三部分：训练集(train set)，验证集(validation set)和测试集(test set)。
✦训练集 —— 用于模型拟合的数据样本。
✦验证集 —— 是模型训练过程中单独留出的样本集，它可以用于调整模型的超参数和用于对模型的能力进行初步评估。
✦测试集 —— 用来评估最终模型的泛化能力。但不能作为调参、选择特征等算法相关的选择的依据。
将这几个概念映射到代谢标志物筛选流程中，则发现阶段1中的人群对应为训练集，部分文章也称其为发现集；发现阶段2中的人群对应为验证集；验证阶段中的人群对应测试集；建模阶段中的人群可来源于验证集，也可来源于测试集（独立于验证阶段中的人群）。
样本量估算
在明确了研究思路以后，接下来我们就看一下具体的样本数应该如何估算。
影响样本量计算的重要参数如下：
①研究设计类型（如横断面研究或随机对照研究）
②结局指标类型（二分类变量或连续变量）
③结局指标的预计值（敏感度或特异性或平均值或AUC）
④容许误差
⑤ 检验水准α（通常取α=0.05）
⑥检验效能1-β（通常为80%或更高）
⑦ Case组与control组的比例：control组的样本量一般不宜少于Case组的样本量，通常是等量的。
对于横断面研究，单样本临床诊断试验的样本量计算方法如下：
01
根据灵敏度及特异性计算样本量
δ指容许的灵敏度或特异度95%区间的宽度，是研究者人为指定，一般定在0.03~0.1。
例如将参数设置为⇩⇩⇩
特异度：90%±10%；
敏感度：80%±10%；
显著水平（α）：0.05；
置信度（1-α）：0.95；
检验类型：two-sided test
根据公式计算得出：
根据敏感度和特异度分别计算出两个样本量数值，选择较大者即为所需要的样本量。本例公式计算得出样本量为62例。
也可使用PASS软件直接进行计算：
敏感度计算所得样本量
特异度计算所得样本量
本例结果显示：通过敏感度计算所得 N=70，通过特异度计算所得N=44，选择数值大者，即需要70例研究对象 。
PASS软件计算结果与公式计算结果稍有偏差，可以选择样本数大的结果，即所需要样本数为对照70例，病例70例。
02
根据AUC值计算样本量
软件：MedCalc
例如将参数设置为⇩⇩⇩
预计AUC=0.9
检验水准α：0.05
检验效能1-β：0.9
无效假设：AUC=0.8
根据软件计算得出样本量为82+82=164例
在机器学习中，一般训练集、验证集和测试集三者切分的比例是6：2：2。若不设置验证集，则训练集与测试集的切分比例为7：3，映射到代谢标志物筛选流程中，则对应建模队列与验证队列的比例为7：3。
样本纳排标准
代谢组结果易受环境等外在因素影响，因此若要筛选到真阳性的代谢biomarker，样本的入组条件需进行严格的限制。
01
样本纳入条件
✦根据实验设计，随机选择符合分组要求的样本。
✦ 尽量保证年龄，性别等与研究无关的临床指标在各分组间无差异。
✦样本选择应尽量具有时间、地域的随机性。
✦纳入的样本符合采样标准流程，并且相应的临床信息完整。
常见待收集临床信息如下表：
02
样本排除条件
✦样本具有严重的急性感染；
✦样本具有严重贫血；
✦样本肝肾功能不全；
✦样本患有肿瘤或多处肿瘤；
✦样本处于妊娠期；
✦样本患有自身免疫缺陷疾病；
✦样本患有高血脂和高黄疸。
以上排除条件仅应用于非本项疾病的研究中（即若开展妊娠期糖尿病相关研究，则第5点排除条件不适用）。
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