DMPK专栏 | 通过LC-MS/HRMS和LC-MS/MS定量人血浆中的纳武利尤单抗(Nivolumab)
摘要
纳武利尤单抗(Nivolumab)是一种全人免疫球蛋白 G4,用于治疗几种晚期实体癌,作为免疫检查点抑制剂。血浆中 mAb 的定量存在一些挑战,因为 IgG 固有地存在于复杂的生物基质中,这种测定必须基于可靠、选择性、 和准确的分析方法。本研究描述了在两个独立实验室中进行的两种经过验证的方法,一种是使用三重四极杆串联质谱 (LC-MS/MS) 开发的,另一种是使用轨道阱系统 (LC-MS/HRMS) 开发的高分辨率质谱。两种方法都使用全长稳定同位素标记的 nivolumab 样(精氨酸 13C6-15N4 和赖氨酸 13C6-15N2)作为内标。样品制备基于 IgG 免疫捕获,然后进行胰蛋白酶消化,并以阳性模式定量一种替代肽。对于LC-MS/HRMS和 LC-MS/MS,测定分别在 5–100 μg/mL 和 5–150 μg/mL 范围内显示出良好的线性。LC-MS/HRMS 和 LC-MS/MS 的定量限分别设定为 2 和 5 μg/mL。两种方法也获得了可接受的准确度(从 - 13.6% 到 3.0%)和精密度(20% 以内)值。两种 LC-MS 方法显示出非常不同的基质效应,这与使用不同的分析柱和洗脱梯度有关。
关键词:Nivolumab;LC-MS/HRMS ;LC-MS/MS;Strata X;
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样品信息:用户保密
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实验部分(仪器、试剂与材料)
1
主要仪器设备
UltiMate 3000 with Q-Exactive Plus Orbitrap (Thermo Scientific, Bremen, Germany)
Exion with 6500 QTRAP (Sciex, Framingham, U.S.A)
2
试剂材料
甲醇、乙腈、甲酸为质谱纯;氨水为分析纯;
Strata-X; 20 x 2.0 mm, 25 μm;
3
样品预处理
Protein G板,板的每个孔都用 200 μL PBS(1X) 洗涤两次,正压或负压去除 PBS。将 20 μL 血浆(标准品、质量控制、患者样品)与 80 μL 含有 SIL-NIVO 样(最终浓度 20 μg/mL)的 PBS (1X) 混合,并将混合物分布在板上。然后将板置于室温下的定轨振荡器上。孵育 1 小时后,用 200 μL PBS (1X) 洗涤树脂 3 次。
4
样品净化
LC-MS/HRMS通过使用两次 150 μL 洗脱缓冲液(水/乙腈,50/50,v/v,含 0.1% FA)进行洗脱,然后进行离心步骤(1000g,1 分钟)。将两个部分合并,然后在温和的氮气流下在室温下干燥。残留物用 45 μL 碳酸氢铵 (100 mM) 重悬,洗脱的 IgG 在 37°C 下用 2 μg 胰蛋白酶金消化 16 小时。加入 FA(终浓度为 1%)停止反应后,将样品离心(5 分钟,13 000 g),将 20 μL 澄清的上清液注入色谱装置。
LC-MS/MS用于洗脱的缓冲液是水和乙腈的混合物(70/30,v/v,含 0.5% FA),在快速真空蒸发之前,先用 200 μL 进行两步洗脱。用30 μL 胰蛋白酶消化液再悬浮。在 37°C 下过夜消化蛋白质。然后,将 20 μL 提取的样品注入 LC-MS。
5
LC-MS/HRMS色谱条件
色谱柱:在线样品净化柱(Strata-X; 20 x 2.0 mm, 25 μm)
Luna Omega PS-C18 (100 × 2.1 mm, 1.6 μm);
泵1:流动相0.1% FA水:0.1% FA乙腈 (95/5; v/v)
泵2:流动相A:0.1%甲酸水溶液;
流动相B:0.1%甲酸乙腈溶液;
流速:150 μL/min;
柱温:30 ℃
进样量:20 µL
流动相梯度:见表1
表1.流动相梯度表
时间 (min) | A% | B% |
0 | 95 | 5 |
8 | 90 | 10 |
9 | 10 | 90 |
9.1 | 95 | 5 |
12 | 95 | 5 |
6
LC-MS/MS色谱条件
流动相A:0.1%甲酸水溶液;
流动相B:0.1%甲酸甲醇溶液;
色谱柱:Biozen XB-C18 (100 × 2.1 mm, 2.6 μm);
流速:100 μL/min;
柱温:40 ℃
进样量:3 µL
流动相梯度:见表2
表2.流动相梯度表
时间 (min) | A% | B% |
0 | 100 | 0 |
1.5 | 100 | 0 |
5 | 65 | 35 |
15 | 0 | 100 |
19 | 0 | 0 |
19.1 | 100 | 0 |
29 | 100 | 0 |
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实验结果
结论:
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对于LC-MS/HRMS和 LC-MS/MS,测定分别在 5–100 μg/mL 和 5–150 μg/mL 范围内显示出良好的线性。LC-MS/HRMS 和 LC-MS/MS 的定量限分别设定为 2 和 5 μg/mL。两种方法也获得了可接受的准确度(从 - 13.6% 到 3.0%)和精密度(20% 以内)值。
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本文部分摘自:《Talanta》Quantification of nivolumab in human plasma by LC-MS/HRMS and LC-MS/MS, comparison with ELISA