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超干软文 | 肿瘤空间代谢组学方案（下）

迈维代谢

2022.4.16

前言

本系列文章着重讨论空间质谱成像技术在肿瘤方向具体应用，理论层面展示代谢物在癌症发生过程中扮演的角色，列举空间代谢组在癌症中研究方向，应用环节将解析肿瘤空间代谢组学具体操作，包含方案设计、样本收集要素、实验流程、数据分析、数据挖掘等。上期讨论了癌症代谢特征以及空间代谢组学在癌症中的研究方向（点击可查看），本期我们将对空间代谢组学在肿瘤机理及标志物研究中的具体方案进行分享，包含分组设计、样本制备、检测流程、数据处理等内容。

研究流程

小迈调研了3年来20篇空间代谢组筛选肿瘤标志物及研究机制的文章，杂志影响因子从5.226分的LaboratoryInvestigation到23.059的Gut，从而汇总了空间代谢组在肿瘤研究中的方案流程，总共包含四个部分背景调研、方案设计、空间质谱成像及数据分析。

1. 背景调研

正式实验之前，需进行背景调研，以了解空间代谢组学在癌症研究中的可行性及研究价值。

背景调研主要分为两个部分，第一部分对癌症进行调研，主要包含肿瘤流行病学特征、肿瘤与代谢的关系。如在食管癌研究中，作者首先介绍了食管癌流行病学特征：全球第八大最常见的恶性肿瘤，每年导致约500,000人死亡，发病率正在持续上升，但存活率仍然很低；接着介绍了食管癌与脂质紊乱的关系：大多数脂质以甘油磷脂（GPLs）的形式储存在双分子膜中，基于甘油磷脂具有较稳定的物理化学性质，因此将其作为疾病诊断的生物标志物具有重要意义。

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空间分辨代谢组学以发现肿瘤相关的代谢改变（ChenglongSun,etal.2019）

第二部分主要是对空间代谢组技术进行调研，对空间代谢组技术进行简单讲解，然后阐述空间代谢组技术在癌症中的研究进展。以一篇乳腺癌研究为例，首先表明基质辅助激光电离质谱成像(MALDI-MSI)是一种无标记技术，用于表征组织中多种内源性物质的空间分布；接着表明对癌组织中代谢物-肉碱的空间分布进行成像是可行的。

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基于质谱成像的代谢组学可视化乳腺癌肉碱代谢的空间分辨重编程（ChenglongSun,etal.2019）

背景调研可在NCBI网站Pubmed板块、Webof Science、中国知网、万方等网站输入关键词cancer、Massspectrometryimaging、metabolism、具体癌症名称进行搜索，对检索到的文献进行汇总，以了解癌症现状及空间代谢组在癌症中的应用。

2. 方案设计

通过对20篇文献归纳总结，发现方案设计可根据样本组别分为3中模式，即1组、2组、3组及以上。

模式一：1组样本

1组样本通常直接采集病人癌症相关组织，制备成实验切片。切片包含癌症组织和癌旁组织，其中癌旁组织可包含多种组织类别，如上皮组织、肌肉组织、脂肪组织、基质等。以一篇前列腺癌研究为例，学者切除15名前列腺癌患者前列腺，制备切片进行MALDI-TOF（空间代谢组技术）实验，切片包含癌症组织、基质、非癌上皮组织。

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前列腺组织HE染色结果（MariaK. Andersen,et al.2021）

模式二：2组样本

2组样本通常需采集癌症相关组织和正常健康组织，正常健康组织可来源于健康人，也可来源于病人离癌症组织有一段距离的健康组织，如食管癌中可判定间距>5cm的为健康组织。同样癌症相关组织可包含癌症组织和癌旁组织，其中癌旁组织可包含多种组织类别。以一篇结直肠癌研究为例，学者采集了九对结直肠癌组织和邻近的正常组织进行了空间代谢组研究。

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结肠癌组织和正常组织H&E染色（FengChen,et al.2020）

模式三：3组样本

3组样本通常需采集癌症相关组织和正常健康组织，癌症组织可根据癌症分型或者分级进行分组。健康组织来源同模式二，癌症相关组织特性同模式一。以非小细胞肺癌研究为例，研究人员取了22例正常肺组织、26例腺癌组织和25例鳞状细胞癌进行空间代谢组研究。

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肺组织H&E染色（AlenaV. Bensussan,et al.2020）

生物学重复

根据文章归纳结果，生物学重复满足4个即可发表文章，一般生物学重复>10个较好，可冲击高分杂志。

空间代谢组在癌症中的研究

空间质谱成像

肿瘤空间代谢组研究中，通常也会进行H&E染色对组织进行病理区域划分，在此版块我们将会着重讲下空间代谢组技术—空间质谱成像。

空间代谢组学是整合质谱成像（Massspectrometry imaging,MSI）和代谢组学（Metabolomics）技术，对动/植物组织中代谢物的种类、含量和空间分布进行精准测定，扩展了代谢组信息维度，对生命科学研究具有重要意义。

1. 技术选择

质谱成像技术（MSI）是基于质谱发展起来的一种分子成像技术；按照离子源的不同，常把MSI分为四类（如下图），本公司采用MALDI-MSI技术（基质辅助激光解吸电离质谱成像），常用技术还有DESI-MSI技术，接下来简要讲解下两种技术。

MALDI-MSI技术将分析物分散在基质分子中并形成共结晶，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射吸收能量并导致迅速产热，使基质晶体升华；基质和分析物膨胀并进入质量分析器，从而获得样本表面各像素点离子的质荷比和离子强度；与质谱成像软件结合，获得对应离子的信号强度和其在样本表面的位置，绘制出对应分子或离子在和样本表面的二维分布图。

MALDI-TOF MS原理图

DESI-MSI技术基本原理是液滴携带机制，将雾化溶剂液滴冲击组织切片表面，使待分析物直接解吸和电离，然后溅射进入气相，经氮气吹扫带电液滴去溶剂化，最终形成气相离子的过程，然后离子进入质谱接口进行检测。

DESI-MSI原理图

MALDI-MSI VS DESI-MS

MALDI-MSI和DESI-MS技术由于原理不同，各具优劣势。DESI-MS技术开放环境，无需复杂的样品前处理，无需基质，但空间分辨率低，信号易受外界环境干扰。接下来我们通过表格具体比较MALDI-MSI与DESI-MS优劣势。

综合而言，MALDI-MSI相比DESI-MSI具有绝对优势：

1、分辨率高，更有利于样本微观结构解析；

2、高灵敏度，有效提高物质检出数量；

3、扫描速度快，有效降低仪器造成的定量误差；

4、可筛选基质，保证物质检出均匀性，并可根据关注物质，进行靶向个性化实验；

5、物质检出数量多。

2. 实验流程概述

MALDI-MSI实验流程涉及步骤众多，具体可见下图，其中需重点关注样本获得、切片实验、分辨率选择。

3. 样本获得

取样步骤

取样步骤主要分为4步；1、耗材准备；2、样本获得；3、液氮速冻；4、保存运输，具体步骤见下图：

包埋与否

为保证组织切片完整性，部分组织样本需要包埋，以便得到更理想的实验数据。是否需要包埋主要参考2点：1、组织含水量；2、组织密度，即是否含有空腔。含水量多、含空腔结构组织需要包埋，如肺、眼球等，其他组织可鲜样进行切片实验，如脑、肝、肾、心等。

包埋剂选择

✦可选1%~2%羧甲基纤维素（CMC）、10%-25%明胶或羟丙基甲基纤维素（HPMC）+聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为包埋剂；

✦不建议选用OCT、石蜡作为包埋剂；

✦福尔马林固定、染色剂（如HE染色）等处理后的样品，对质谱检测有一定影响，不建议进行空间代谢组检测。

迈维小视频

迈维针对样本准备（取样步骤、包埋步骤、切片步骤），特贴心录制小视频，以帮助老师更好的进行样本准备，如有需求，可扫描下方二维码进行观看。

4. 切片实验

很多老师拿到样本后，会迷惑样本怎么切好，是选择横切还是纵切？如何进行切片实验主要看是否满足研究目的，遵循两点：1、最大程度保证组织结构完整性，2、满足1的基础上，保证各结构横切面积最大化，以最大可能保证分子水平可对各微观结构进行区分。如在下图研究中，研究者需了解蚊子各组织部位代谢物分布情况，则选择延整只蚊子躯体纵向切开，以保证各组织器官完整性，若延某方向斩断蚊子躯干，则所切部位有限，无法满足实验需求。