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STTT | 空间代谢组学探究口服小檗碱通过肠道菌群改善大脑多巴/多巴胺水平

鹿明生物

2022.6.27

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前言

肠道微生物群是影响大脑功能的一个公认的因素，但机制目前尚不清楚。多巴胺是一种主要的神经递质，它在大脑中的表达水平与大脑功能密切相关。多巴胺主要在脑神经元细胞中合成，在人体内有两个阶段。Tyr-dopa-dopamine转化是第二阶段，由酪氨酸羟化酶（TH）和多巴脱羧酶（DDC）在大脑中完成。

2021年2月，Signal Transduction and Targeted Therapy发表了题为 “Oral berberine improves brain dopa/dopamine levels to ameliorate Parkinson''s disease by regulating gut microbiota ”（IF：18.187）的研究成果，通过空间代谢组学和LC-MS非靶代谢，对小鼠模型进行口服小檗碱和肠道菌移植研究，发现了肠道菌群是体内多巴/多巴胺的新来源，为小檗碱用来改善帕金森病提供了理论依据。

研究背景

细菌可能含有哺乳动物用来产生多巴胺的酶基因的同源物，事实上，一些细菌可以被视为生产多巴/多巴胺的生物技术工厂，比如人肠道中的肠球菌。最近的研究表明，肠道微生物群可以通过微生物的衍生代谢物（如血清素）调节大脑功能。小檗碱（BBR）是一种天然化合物,从草本植物中分离，在中国一直被用作治疗腹泻患者的非处方（OTC）药物，有研究发现BBR有改善帕金森（PD）的作用。

研究思路

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研究结果

1.BBR增加体内肠道微生物群中多巴/多巴胺的产生

研究表明，在小鼠口服BBR组中，6小时内肠道细菌的多巴/多巴胺的产生显著增加了（图1a）。肠道多巴/多巴胺随后进入血液和大脑(仅多巴)，血液和大脑中的多巴/多巴胺增加，且和剂量和时间相关（图1b和c）。为了验证肠道微生物群在BBR诱导的多巴/多巴胺增加中的作用，使用抗生素预处理小鼠，再口服BBR进行实验。

结果发现，经过抗生素处理的小鼠，肠道菌落数明显降低，并且口服BBR的小鼠的粪便、血液和大脑中多巴/多巴胺未增加。口服抗生素似乎在很大程度上降低了肠道菌群的丰度，从而降低了它们在肠道中产生多巴/多巴胺的能力。

此外，为了了解BBR在没有肠道细菌的条件下的直接作用，通过注射BBR对ICR小鼠进行治疗，发现并未引起粪便、血液和大脑中多巴酚/多巴胺水平的变化（图1），这表明肠道微生物群对于BBR诱导的体内多巴/多巴胺的增加至关重要。

同位素（15 N）标记的酪氨酸（15 N-Tyr）来检测大脑多巴胺的来源，结果显示，肠道15 N-Tyr是脑内15 N-多巴胺合成的原料，口服BBR可显著增加脑内15 N-多巴胺（图1f）。

为了进一步验证这一假设，将ICR小鼠的血液、肝脏匀浆、脑匀浆和肠道菌群与15 N-Tyr 分别在体外进行检测，结果在大脑匀浆和肠道细菌中检测到15 N-多巴胺，血液和肝脏匀浆中并未检测到。这表明脑和肠道细菌是体内多巴胺生物合成的主要部位。

图1 | BBR增加了体内肠道微生物群中多巴/多巴胺的产生

2.BBR刺激肠道细菌在体外产生多巴/多巴胺

在体外进行实验，使用BBR治疗肠道菌群，增加其多巴/多巴胺的产生。作者检测了BBR对十种肠道菌株的影响（图2a）。其中4种菌株（粪肠球菌，屎肠球菌，奇异变形杆菌和嗜酸乳杆菌）在BBR处理后，多巴显著增加，有3种菌株的多巴产生几乎没有变化。此外，对于多巴胺来说，3种菌株（屎肠球菌、粪肠球菌和表皮葡萄球菌）的多巴胺含量在BBR处理后显著增加，有4株菌株的多巴胺几乎没有变化（图2b）。

随后，作者选择了粪肠球菌和屎肠球菌用于后续的研究。两种菌株的多巴在BBR处理后6和12小时增加，但粪肠球菌的增加在24 h消失，可能是由于多巴转化为多巴胺了。另外，加入BBR培育小鼠脑、肠和肝脏的组织匀浆时，多巴/多巴胺水平没有增加。这证明肠道微生物群是BBR在体内多巴/多巴胺的生产者。

此外，还检测到肠道细菌组成的变化。在50个属中，18个在BBR处理后丰度增加，其中4个属被记录为多巴/多巴胺生产者（图2）。这表明，BBR可能是通过刺激菌群中的多巴/多巴胺生物合成菌的丰度来增加多巴/多巴胺的丰度。

图2 | BBR刺激肠道细菌产生多巴/多巴胺

3.BBR激活了肠道微生物群中的多巴/多巴胺生物合成，改善了动物的大脑功能

TH（酪氨酸羟化酶）和DDC（多巴脱羧酶）是两种关键酶，分别将酪氨酸转化为多巴，然后将多巴转化为多巴胺。酶测定显示，体外BBR处理使肠道菌群中的TH活性提高了23%，DDC水平提高了28%（图3a）。随后研究了抑制这两种酶能否抑制BBR诱导的肠道微生物群中多巴/多巴胺的产生，结果显示，BBR增加多巴/多巴胺生物合成是通过刺激活化TH和DDC来产生的。

图3 | BBR激活了肠道微生物群中多巴/多巴胺合成的途径

虽然TH和DDC存在于大脑中，但脑匀浆中加入BBR并没有增加大脑中多巴/多巴胺的水平（图3e）。但是，脑匀浆与dhBBR（一种由肠道菌群中硝化还原酶产生的BBR代谢物）的混合，显著增加了大脑中多巴/多巴胺的水平。作者发现TH的活性和DDC的水平被dhBBR升高。推定的dhBBR对TH活性的化学机制如图4所示。

图4 | dhBBR介导从酪氨酸转化为多巴的化学反应

事实上，有体内实验表明，dhBBR只能在肠道中检测到，但在血液和大脑中却不能检测到，这支持了由BBR增加的大脑中多巴胺来自肠道微生物群的假设。

在PD小鼠模型中进行了脑功能测试，用来研究BBR诱导的多巴/多巴胺增加是否可以改善动物的身体表现。化学分析表明，到实验的第7天，BBR口服治疗组脑组织中的多巴/多巴胺显著高于疾病模型小鼠（图5b）。

BBR部分改善了脑功能损伤，肠道微生物群中多巴/多巴胺产生的增加可能是该机制的一部分。在该实验中，左旋多巴治疗显示出优于BBR的治疗效果，可能是因为它与DDC抑制剂卡比多巴联合使用。

图5 | 粪肠球菌和屎肠球菌调节多巴/多巴胺，并在存在BBR的情况下改善PD动物的脑功能

4.动物粪肠球菌和屎肠球菌移植可增加脑多巴/多巴胺并改善脑功能

首先，在两种菌株中检测到TH和DDC很高的酶活性，但它们之间没有明显差异。然后，作者将粪肠球菌和屎肠球菌移植到用抗生素预处理的PGF小鼠中。小鼠被随机分为7组（使用不同的治疗方式），然后收集脑、血液和粪便进行多巴和多巴胺测量。结果显示，BBR处理没有增加PGF小鼠中多巴/多巴胺的水平，但促进这两种菌在PGF小鼠中合成多巴/多巴胺（图5d-f）。

用抗生素治疗可以减少小鼠肠道中的细菌菌落，但是PGF小鼠粪便、血浆和大脑中的多巴和多巴胺没有显著变化，可能是因为肠道微生物群不是自然界中大脑多巴胺的主要贡献者，以及肠球菌对抗生素的耐药性相对较高。

总之，粪肠球菌和屎肠球菌如果移植到体内，可能在多巴和多巴胺的合成中起关键作用。并且在PD模型小鼠中观察到细菌和BBR对行为学的改善作用。

5.通过空间代谢组学对ICR小鼠大脑多巴胺分布进行空间成像

使用空间代谢组学研究了纹状体多巴胺在各组中的分布。结果如图6所示，与仅用菌治疗小鼠的第3组和第5组相比，从全脑和半脑的角度来看，接受两种菌株和BBR治疗的小鼠的纹状体多巴胺水平要高得多（图6a-d），这个结果与前面用大脑均质物获得的结果一致。

这表明BBR可能具有通过增加BH来刺激粪肠球菌和屎肠球菌的多巴/多巴胺代谢途径。这种相互作用最终导致大脑中多巴胺的量增加，其中BBR与粪肠球菌或屎肠球菌的组合显示出比单独用粪肠球菌或屎肠球菌治疗的升高更高

图6 | BBR刺激了移植粪肠球菌和屎肠球菌的小鼠纹状体中多巴胺的产生

6.BBR增加临床受试者血液多巴/多巴胺

为了研究BBR是否能增加人类血多巴，作者纳入了28名高脂血症患者的BBR治疗研究。在BBR治疗8周后，患者血多巴/多巴胺升高，粪便的结果和血液相似，同时，肠道微生物群中的TH和DDC被BBR上调。结果与动物实验中检测到的结果一致。对28例临床患者粪便样本中微生物多样性的分析表明，经过2个月的BBR治疗，肠球菌的相对丰度增加了11%，且粪肠球菌和屎肠球菌占主导。

研究结论

该文章首先发现了肠道菌群是体内多巴/多巴胺的新来源，肠道菌群产生的左旋多巴通过循环进入大脑并转化为多巴胺。为了验证由BBR作用激活的肠脑轴，将粪肠球菌或屎肠球菌移植到帕金森病（PD）小鼠中。菌株移植显著增加大脑多巴胺并改善小鼠的PD表现。此外，BBR与菌株的结合显示出比单独使用菌株更好的治疗效果。

空间代谢组学鉴定出菌株移植小鼠大脑中纹状体多巴胺水平升高，并且BBR增强了脑多巴胺的成像强度。此外，一项针对28名高脂血症患者的研究证实，口服BBR会通过肠道菌群增加血液/粪便中的左旋多巴。这些结果表明，BBR促进肠道中左旋多巴的产生。BBR多年来一直是一种OTC药物，它可能在调节脑-肠轴和改善人类大脑功能方面具有立即适用的潜力。

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本文章使用小鼠模型，通过常规LC-MS非靶代谢技术，研究了口服小檗碱对小鼠血液、粪便和脑等多巴/多巴胺的变化，发现了肠道菌群是体内多巴/多巴胺的新来源，且通过影响肠道菌群丰度来增加多巴/多巴胺的含量。还通过空间代谢组学，观察到了BBR和肠道菌群对小鼠大脑中纹状体多巴胺的变化。

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