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项目文章 | Sci. Total Environ. 转录组+代谢组学助力冯丽萍课题组探究双酚F(BPF)暴露肠道毒性机制

鹿明生物

2022.4.07

前言

2021年11月，上海交通大学医学院附属新华医院冯丽萍教授课题组在Science of the Total Environment期刊发表了题为“Transcriptomics integrated with metabolomics reveals the effect of Bisphenol F (BPF) exposure on intestinal inflflammation ”的研究成果，通过GC-MS非靶向代谢组学和转录组学研究方法，发现了BPF暴露的肠道毒性的特征，探究了可能的发病机理。

基本信息

中文标题：转录组学结合代谢组学揭示了双酚F(BPF)暴露对肠道炎症的影响

研究对象：人结肠粘膜上皮细胞系(NCM460)

发表期刊：Science of the Total Environment

影响因子：7.963

发表时间：2021年11月

合作单位：上海交通大学附属新华医院

运用生物技术：GC-MS非靶向代谢组学（由鹿明生物提供技术支持）、转录组学、qRT-PCR

研究背景

BPA是一种内分泌干扰物，对人体健康有害。有研究表明，长期暴露在BPA中，会诱发高血压、糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖和复发性流产等疾病。因此，制造商现在使用双酚类似物，例如双酚F(BPF)、双酚S(BPS)和双酚AF(BPAF)来替代。BPF被广泛应用于我们日常的包装产品中，有研究发现一些亚洲的水样本中BPF的浓度高达2850 ng/L。除此之外，BPF可以从食品包装或水瓶中渗出，从而通过饮食进入人肠道系统中。多项研究表明，BPF可能与BPA具有类似的潜在健康危害，例如导致斑马鱼雌激素受体基因和甲状腺激素水平显著增加；对人类生殖造成影响，可能导致女性的特发性不孕症；围产期暴露造成雄性小鼠后代肝脏代谢紊乱。

除此之外，还造成一些肠道的疾病。该研究为了评估BPF暴露对肠炎症的潜在不良影响，检测了促炎细胞因子的水平变化，以及肠上皮细胞NCM460中肠上皮紧密连接(TJ)蛋白、occluds -1 (ZO-1)和CLDN1(CLDN1)的变化。还使用转录组学和代谢组学相结合的方法来探究BPF肠道毒性的潜在机制。

研究思路

研究结果

BPF暴露引起lps刺激细胞炎症细胞因子表达上调在NCM460细胞中

暴露在浓度为 10−7、 10−6和 10−5 M的BPF中48小时后，并未引起细胞活性的变化。浓度为 10−6 M的BPF暴露的细胞与DMSO（二甲亚砜）处理的细胞相比再经过脂多糖处理后，IL-17A (图 1b)、 TNF-α (图 1e) 和IFN-γ (图 1f）的基因的表达量显著上调。此外，这三个基因在10−6 M的BPF处理中，表达量明显高于10−7M和10−5M。与对照组相比，单独使用BPF和LPS处理均未显著增加这些促炎细胞因子基因的表达（图1）。因此，研究者选择浓度为10−6 M的BPF进行后续实验。

图1 | BPF暴露导致NCM460细胞中炎症细胞因子水平升高

BPF暴露和脂多糖导致NCM460细胞中紧密连接断裂

作者使用RT-qPCR、免疫荧光显微镜和Western blot检测了NCM460细胞中两个细胞紧密连接蛋白ZO-1和CLDN1的表达水平。RT-qPCR结果显示在BPF暴露和LPS刺激组，这两种蛋白明显下调。此外，与DMSO处理的对照组细胞相比，BPF暴露的NCM460细胞的ZO-1和CLDN1的免疫荧光染色western blot信号通路强度减弱。

图2 | BPF暴露导致NCM460细胞中肠紧密连接薄弱

BPF处理后NCM460细胞的差异表达基因(DEGs)和转录组分析

使用Fold change 2和pvalue＜0.05为标准，200个基因在BPF处理组和Con组之间有差异表达，其中94个上调，106个下调(图3b)。GO富集分析显示，差异基因在细胞发育负调控、神经系统发育负调控和受体活性调控生物过程中显著富集。

在KEGG通路分析中(图3d)， 70%的差异基因与信号转导相关，40%的差异基因与内分泌系统相关，30%的差异基因与神经系统相关，20%的差异基因与免疫系统相关。根据GSEA分析，在BPF处理组中，Ras(图3e)和磷脂酶D(图3f)信号通路显著富集。EGR1、RASGRP2、GRM3和PLA2G4E基因的表达使用RT-qPCR进行了验证(图4)。

图3 | BPF处理后的NCM460细胞的转录组分析

图4 | 使用RT-qPCR验证转录组表达谱的差异基因

BPF治疗改变肠上皮细胞NCM460的代谢谱

使用GC-MS非靶向代谢组学对BPF处理与DMSO处理细胞培养上清液中的代谢物进行检测。总共检测出 266个代谢物，其中45个在两组间存在明显差异（图5d）。这些差异代谢物主要与缝隙连接、色氨酸代谢、cAMP信号通路和神经活性配体-受体相互作用相关（图5e，P＜0.05）。

图5 | 代谢组学分析用于定量BPF处理组和对照组(DMSO处理组)的代谢物

对照组和BPF处理组中不同代谢物的层次聚类分析

聚类和多变量分析表明，差异代谢物呈现4个大的聚类：苯类化合物、脂类和类脂分子、有机酸及其衍生物及有机氧化合物和有机杂环化合物(图6a)。布托啡诺、精胺、焦糖磷酸盐、焦糖没食子酚、n -乙酰-5-羟色胺、异苏氨酸、琥珀酸乙酯、吡哆醇、n -乙酰腐胺和5-羟色胺能够将BPF处理组和对照组区分开(图6b和c)。总的来说，BPF处理组有着独特的代谢组特征，值得深入研究这些代谢物与肠道发育以及与BPF暴露相关疾病的关系。

图6 | 差异转录本、代谢物和促炎细胞因子的相关性分析

差异转录本、代谢物和促炎细胞因子的相关性分析

相关性分析表明，在Ras信号通路、磷脂酶D信号通路和神经活性配体-受体相互作用中显著富集的差异基因与BPF处理组中丰度较高的代谢物高度相关。此外，SLC6A19与布托啡诺、精胺、异苏氨酸、n -乙酰腐胺、2-甲基丙烯酸乙酯和5-羟色胺呈负相关(图6d)。作者发现，在BPF处理组中，这些与转录相关的代谢物在色氨酸代谢和cAMP信号通路中显著富集。相关性分析还表明，BPF处理组的布托啡诺、精胺、n -乙酰-5-羟色胺等物质与IL-17A水平呈正相关(图6e)。总的来说，综合分析揭露了NCM460细胞在BPF暴露后差异基因、鉴别代谢物和促炎细胞因子之间的关系。

研究讨论

总的来说，这些结果强调了BPF暴露的肠道毒性，以及证明了这种暴露可能会导致肠道炎症，并改变肠上皮细胞的转录组和代谢组谱。联合分析表明了炎症反应、转录组和代谢组变化之间的组织协调。

文章提供的数据解释了BPF暴露在肠道炎症发病机制中的可能作用，以及和肠道炎症相关疾病之间的关系。除此之外，该文章证明了采用多组学分析和体外模型来识别BPF类似物的毒性和干扰途径的可行性，而且这种分析和模型可以减少传统体内测试所需的工作量。

小鹿推荐

通过转录组学和代谢组学（GC-MS非靶向代谢组学）对BPF暴露和对照组的细胞进行分析，筛选到差异的基因和代谢物。分别通过富集分析，找到差异基因或代谢物参与的条目或通路。最后通过差异转录本、代谢物和促炎细胞因子的综合分析，揭露了它们之间的关系。本文通过多组学分析和体外模型的方式，发现了BPF暴露后肠上皮细胞转录组和代谢组谱的改变，揭露了BPF可能在肠道炎症发病机制的作用。

文末看点｜lumingbio

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