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TDM实战 | 二维液相色谱法进行万古霉素/去甲万古霉素的治疗药物监测
万古霉素与去甲万古霉素均为三环糖肤类抗生素，为快效杀菌剂，临床上主要用于严重革兰阳性菌感染，特别是对严重耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）所致的感染。由于其治疗窗窄（有效剂量和中毒剂量较为接近），因此提出了需要进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM），及时调整给药方案。
目前已有较多指南推荐万古霉素应进行治疗药物监测，并给出监测方案及剂量调整方案。医院限于抗生素总品种数限制，通常只会保留万古霉素和去甲万古霉素的其中一种，那么去甲万古霉素的临床应用如何呢？今天就来聊一聊，如何通过二维液相色谱法进行万古霉素和去甲万古霉素的血药浓度监测。
为什么要进行TDM？
万古霉素/去甲万古霉素同属于糖肽类抗生素，结构相似。对MRSA、耐甲氧西林表皮葡糖球菌、肠球菌属等有较强抗菌作用。两者都存在潜在的耳毒性、肾毒性，且治疗窗很窄。有证据表明万古霉素血药浓度＜20mg/L，为治疗作用；＞20mg/L，肾毒性风险增加。开展TDM可显著提高治疗有效性，并降低肾毒性发生风险。因此有必要进行TDM。
需要对哪些人群进行TDM？
对于危重症、肥胖、烧伤、同时接受肾脏毒性药物治疗以及肾功能受损的患者，推荐进行万古霉素TDM。
对于儿童、新生儿和接受肾替代治疗(RRT)的患者，建议进行万古霉素TDM。
对于肾功能不稳定的患者，建议进行万古霉素TDM。
对于老年患者（年龄＞65岁），推荐进行万古霉素TDM。
对于中度至重度心力衰竭、肾脏清除率增加（ARC）或体重过轻的患者，推荐进行万古霉素TDM。
如何进行TDM？
TDM的指标
推荐监测谷浓度或24小时血药浓度-时间曲线下面积（AUC24）。
推荐成人患者的稳态谷浓度维持在10-15mg /L。
对于严重MRSA感染的成人患者，建议万古霉素稳态谷浓度维持在10-20 mg/L。
建议儿童患者或新生儿的稳态谷浓度维持在5–15 mg/L 。
建议AUC24维持在400–650 mg × h/L。
TDM的时间
开始TDM的时间
对于肾功能正常的患者，推荐在第3天（万古霉素首次给药48h）开始进行万古霉素TDM。
对于肾功能不全的患者，推荐初始应用万古霉素72 h 开始进行万古霉素TDM。
重复TDM的时间
当首次TDM后调整剂量时，建议在4-5次剂量后重复进行万古霉素TDM。
对于入住ICU的患者、接受血管升压药物治疗者、接受RRT的患者以及严重MRSA感染的患者，建议至少每周重复进行TDM。
重症患者万古霉素血药浓度推荐评估时间
对于重症患者，如需要在达稳态血药浓度前进行评估，则可在开始治疗后的48~72小时内进行检测以及评估，详见下表。
万古霉素给药方案如何确定及调整？
建议应用PK工具进行万古霉素个体化给药。
（药代动力学工具可用于TDM初始剂量计算和剂量调整。经过验证的PK和人群PK模型可以帮助计算初始用药剂量。）
负荷剂量
对于严重MRSA感染的患者，建议给予负荷剂量。当处方负荷剂量时，成人单次剂量为25-30mg /kg，儿童单次剂量为30 mg/kg。
肾功能不全患者中的初始给药方案
新生儿/儿童中的初始给药方案
万古霉素标本采集注意事项
采血时间：万古霉素进行血药浓度检测的是谷浓度，一般首次采血时间为第5剂给药前30分钟；肾功能不全的患者，推荐第7剂给药前30分钟内采样；
采血量：每次每人抽血2～3mL(静脉滴注给药时，不能从留置针采血，应从对侧静脉采血)；
样本采集：血样置于EDTA-2K抗凝管或者血清生化管
去甲万古霉素血药浓度监测及调整意见
使用去甲万古霉素同样需要进行TDM，有文献报道认为去甲万古霉素血药谷浓度范围应在10-20mg/ml内。但也有文献认为使用AUC0-24/MIC（血药浓度曲线图0-24h曲线下面积与最小抑菌浓度的比值）作为TDM监测指标较为合适。目前来看，我们需要更多的关于去甲万古霉素药代 / 药效动力学数据。
采用什么方法进行TDM
进行万古霉素/去甲万古霉素的TDM是必要的，那么应该采用何种方法进行快速且精准的血药浓度监测呢？
推荐采用二维液相色谱法
万古霉素、去甲万古霉素的血药浓度监测主要方法有常规液相色谱法、荧光偏振免疫法( fluorescence polar-ization immunoassay, FPLA)、酶免疫法( enzyme multi-plied inmmunoassasy technique, EMIT)，据文献报道采用EMIT和FPLA法测定时测定值受万古霉素的代谢降解产物的干扰而偏高，常规液相色谱法的前处理较复杂，时间长，一致性较差，而使用二维液相色谱法，采用在线SPE，进行富集除杂，并中心切割进入二维柱中洗脱分析，该方法人为干扰少，操作方便，回收率高，重复性优异，因此采用二维液相色谱测定的方法更便捷和可靠。
血样处理
对于万古霉素与去甲万古霉素的血样提取方法文献报道有固相提取方法、乙腈-异丙醇沉淀蛋白后用二氯甲烷萃取法、高氯酸直接沉淀后用二氯甲烷萃取法等，但在处理血样时，操作较为繁琐。
本文优化了流动相组成与比例，同时将血样提取方法优化为高氯酸沉，然后通过二维系统进样测试，简化了前处理步骤，提高了检测效率。
血样分析
本文采用了科诺美二维液相色谱系统，配套对应的色谱柱、试剂及标准品质控品，建立了血清中万古霉素和去甲万古霉素的含量测定方法。
本方法前处理简单易操作（可采用手工法处理，或采用科诺美前处理设备进行处理），两种物质分离度均大于2.0；定性重复性在0.54%-1.08%、定量重复性在1.22%-4.51%之间；线性关系良好；转移性能大于95%；携带污染小于0.1%。采用科诺美二维液相色谱系统可以完成血清中万古霉素和去甲万古霉素的含量测定。
图1：血清中去甲万古霉素、万古霉素的典型谱图
图2：血清中去甲万古霉素、万古霉素的线性叠加谱图
二维液相色谱法检测原理
样品制备 | 把待测采血管，放入Epostar 200， 进行前处理后，取出96孔板，待测 |
检测物 | 万古霉素、去甲万古霉素 |
色谱柱 | Chromai 一维柱 |
Chromai 专用捕集柱 | |
Chromai 二维柱 | |
检测波长 | 万古霉素、去甲万古霉素的特征波长 |
仪器型号 | Chromai Voyager全自动二维液相 色谱系统 |
1） 自动化的样本处理流程：
待测血样放入样本架，
试剂位放入前处理试剂
样本处理位放入接收板和前处理板
开机自检，选择前处理方法，一键“运行”
拿出接收板，放入Voyager全自动二维液相色谱系统的自动进样器中进样分析
2）试剂盒：方法配套的试剂组分，包括校准品、质控品、流动相、前处理试剂等；
3）耗材包：配套齐全，包括适配的枪头，前处理板、接收板、色谱柱等；
4）分析检测设备：Voyager全自动二维液相色谱系统，方法经过严谨的优化和验证。
使用Chromai自动前处理设备联用二维色谱的解决方案，可快速检测血清中的万古霉素/去甲万古霉素；该方案样品前处理自动完成，回收率高，交叉污染低，预内置方法一键操作，更多减少人为因素干扰，检测更快捷，准确，能有效和及时的为医生提供精准的给药依据，更好的为患者进行个性化治疗。
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科诺美（英文：Chromai），是中国领先的从事分析检测仪器与医疗诊断研发、生产、销售和服务的高科技技术企业。是中国仪器仪表协会、中国医疗器械行业协会会员。公司专注于智能化科学仪器、分析检测与精准医疗。拥有国际水准的先进技术，拥有众多核心的专利技术，自主知识产权填补了国家空白。公司坚持自主创新，以振兴民族产业为己任，愿景是从根本上改变全球行业市场格局，让中国创造享誉全球，将科诺美打造成为卓越的国际品牌。科诺美致力于不断提升效率、降低分析成本，为客户创造价值。
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